La secuenciación con bisulfito es el nombre general de un grupo de métodos destinados a estudiar el patrón de metilación del ADN tratándolo con bisulfito .
La metilación es el primer etiquetado epigenético que se descubre. Afecta el nivel de expresión génica al suprimir la actividad transcripcional . Además, en muchos casos, la metilación es hereditaria [1] [2] , lo que añade interés adicional a su estudio.
El bisulfito actúa sobre el ADN monocatenario , convirtiendo la citosina en uracilo [3] . Si esta citosina está metilada, es decir, un grupo metilo está unido a su quinto átomo de carbono , entonces dicha citosina no sufre transformación. Así, el bisulfito cambia la secuencia de ADN en función de su patrón de metilación, y tras la exposición a él es posible determinar qué dinucleótidos CpG estaban metilados comparando la secuencia alterada con la original.
Los métodos que se describen a continuación utilizan la secuenciación de regiones de ADN tratadas con bisulfito para determinar el patrón de metilación. También existen métodos que no se basan en la secuenciación, como el análisis de restricción de bisulfito combinado ( COBRA ) y la inmunoprecipitación de ADN metilado ( MeDIP ). Las tareas de estudio de los patrones de metilación pueden consistir tanto en estudiar la metilación de una citosina en particular como en determinar la proporción de citosinas metiladas en una determinada región del ADN, o incluso en todo el genoma en su conjunto. De los siguientes métodos, algunos son más adecuados para estudiar sitios de metilación específicos, mientras que otros son más adecuados para estudiar la metilación a niveles más altos. Idealmente, se debe determinar la metilación de cada alelo . Varias revisiones [4] [5] [6] [7] [8] están dedicadas a la descripción de los métodos de secuenciación con bisulfito .
El primer método de secuenciación con bisulfito se describió en 1992 [9] . Para determinar el patrón de metilación se utilizó PCR, cuyos cebadores eran específicos para el ADN tanto alterado como inalterado por bisulfito, es decir, no contenían citosinas incluidas en los dinucleótidos CpG . Para los cebadores, se usaron regiones cercanas al sitio de metilación de interés, pero que no lo contenían. En el caso de que la citosina no estuviera metilada, se encontró timina ( uracilo ) en la secuencia amplificada y adenina en la secuencia complementaria sintetizada . Si la citosina estaba metilada, entonces permanecía en la secuencia amplificada y la guanina se sintetizaba en la secuencia complementaria . Este método requiere mucha mano de obra, ya que requiere la clonación de productos de PCR para lograr la sensibilidad requerida. El mismo problema se puede resolver usando PCR anidado .
En la pirosecuenciación, la PCR se usa con cebadores que amplifican tanto el ADN alterado como el no modificado con bisulfito. La proporción del número de citosinas metiladas y no metiladas en la secuencia amplificable está determinada por la proporción del número de nucleótidos A y G en la secuencia complementaria sintetizada [10] [11] .
Una mejora adicional de este método es el uso de cebadores específicos de alelo con polimorfismos de un solo nucleótido , que permiten el estudio de los patrones de metilación por separado en los alelos paternos y maternos, lo que es especialmente útil en el estudio de la impronta genómica [12] .
Este método se basa en el método de análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla ( SSCA ) . SSCA fue desarrollado para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) [13] . Fragmentos de ADN de la misma longitud, pero diferente secuencia de nucleótidos, se mueven a diferentes velocidades en la electroforesis . En términos generales, SSCA no es lo suficientemente sensible para detectar una sola sustitución, pero con un número suficiente de polimorfismos de dinucleótidos CpG no metilados en ADN tratado con bisulfito y sin tratar, habrá suficiente sensibilidad del método para determinar la proporción de citosinas metiladas en la región bajo consideración. Este método no permite estudiar la metilación en un sitio en particular, pero da una idea de la metilación a nivel de una región determinada o incluso de todo el genoma.
El método de fusión de alta sensibilidad (HRM) se basa en PCR en tiempo real [14] . La temperatura se eleva de 55 a 95 °C, como resultado de lo cual se destruyen los enlaces complementarios entre las cadenas. La tasa de fusión se registra utilizando colorantes fluorescentes especiales y, conociendo la dependencia de la fluorescencia de la secuencia de nucleótidos de las cadenas, se pueden distinguir los polimorfismos de un solo nucleótido. El método no proporciona información sobre exactamente qué dinucleótidos CpG se metilaron y, por lo tanto, no cambiaron durante el tratamiento con bisulfito; sin embargo, proporciona información bastante precisa sobre su cantidad en el área de interés.
El método de extensión del cebador de un solo nucleótido se desarrolló originalmente para el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido [15] . En relación con el análisis de la metilación, se utiliza de la siguiente manera. En el ADN monocatenario tratado con bisulfito, los cebadores se hibridan con el par de bases inmediatamente anterior al sitio de interés de metilación. Luego, el cebador se extiende mediante la ADN polimerasa utilizando didesoxinucleótidos que lo terminan . La proporción del número de citosinas metiladas y no metiladas en la secuencia inicial está determinada por la proporción del número de extensiones de cebadores con nucleótidos G y A , respectivamente. La relación del número de citosinas metiladas y no metiladas en la secuencia inicial se puede determinar de diferentes maneras. Se utilizan marcadores radiactivos o fluorescentes , así como pirosecuenciación [16] .
Además, esto se puede hacer usando desorción/ionización láser asistida por matriz seguida por el uso de un analizador de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa de par iónico (IP-RP-). HPLC) [17] .
El método se basa en el uso de la escisión de ARN específica [18] . Cuando se agrega un promotor de ARN polimerasa in vitro al cebador en la PCR , se sintetiza un transcrito de ARN de la región de interés , después de lo cual es escindido por la ribonucleasa A. La ribonucleasa A escinde el ARN monocatenario en las ubicaciones de los nucleótidos C y U. Utilizando los nucleósidos trifosfato resistentes a la escisión dUTP y dCTP, se puede lograr una escisión específica en los sitios C o Y. Los fragmentos de ARN se analizan luego mediante MALDI - TOF . Este método proporciona información sobre la metilación de cada uno de los dinucleótidos CpG disponibles, y no solo sobre la proporción de nucleótidos metilados.
Este método utiliza cebadores que son específicos solo para el ADN transformado con bisulfito o solo para el ADN no transformado [19] . En consecuencia, solo las regiones que estaban metiladas se unen a los primeros cebadores y las que no estaban metiladas se unen a los segundos cebadores, lo que elimina la necesidad de secuenciar las regiones después de la amplificación.
El ADN amplificado en MSP se puede analizar más a fondo mediante varios otros métodos. El método MethyLight utiliza MSP en tiempo real basado en fluorescencia] [20] . Mc-MSP utiliza análisis de curvas de fusión [21] . El método de fusión altamente sensible utiliza ambos y, por lo tanto, es lo suficientemente sensible como para detectar niveles bajos de metilación [22] .
El uso de micromatrices de ADN permite ampliar los métodos descritos anteriormente para el análisis de la metilación a nivel de todo el genoma [23] . Los oligonucleótidos de la micromatriz de ADN se hacen específicos para la metilación y corresponden a los sitios CpG de interés. Algunos son complementarios a la secuencia alterada por bisulfito (es decir, aquella en la que el sitio CpG no ha sido metilado), mientras que otros no lo son. Un ejemplo de dicho método es el ensayo de metilación de Illumina .
Los métodos de secuenciación con bisulfito tienen una serie de limitaciones. En los mamíferos , la modificación del ADN 5-hidroximetilcitosina está muy extendida. Cuando se trata con bisulfito, la 5-hidroximetilcitosina se convierte en citosina-5-metilsulfonato, que se identifica mediante secuenciación como C. Por lo tanto, la secuenciación con bisulfito no puede distinguir entre 5-hidroximetilcitosina y metilcitosina y, por lo tanto, no puede considerarse un método sensible sólo a la metilación del ADN. En 2012, se desarrolló un método de secuenciación con bisulfito para distinguir entre estas dos modificaciones [24] .
Dado que la conversión incompleta de bases nitrogenadas en el ADN por bisulfito, que solo es posible en el ADN monocatenario, da resultados incorrectos, es necesaria una selección precisa de las condiciones experimentales ( temperatura , concentración de sal) para mantener el ADN en un estado desnaturalizado [4] . El mantenimiento de una conformación monocatenaria del ADN puede facilitarse mediante su fijación en un gel de agarosa [25] .
Otro problema es la degradación del ADN cuando se trata con bisulfito. Dado que el bisulfito actúa sólo sobre el ADN monocatenario, es necesario llevar a cabo la reacción en condiciones en las que el ADN permanecería monocatenario, y llevarla a cabo durante un tiempo suficiente para que la conversión tenga éxito. Sin embargo, tales condiciones, a saber, alta temperatura y largo período de incubación, pueden conducir a la degradación de hasta el 90% de todo el ADN [26] .