IRES ( Eng. Internal Ribosome Entry Site - el sitio de aterrizaje interno del ribosoma ) - el sitio regulador del ARNm de eucariotas y sus virus , que proporciona un inicio de traducción interno o independiente de cap . Con este mecanismo de iniciación, el ribosoma se une al ARNm directamente en la región IRES, que se ubica con mayor frecuencia en la región 5' no traducida (5'-UTR) cerca del sitio de iniciación de la traducción , sin pasar por las etapas de exploración y reconocimiento de caperuza [1] .
Para 2016, se han descrito más de 80 IRES celulares (en levaduras , plantas y otros eucariotas superiores ) y 56 virales. Se han encontrado IRES en miembros de las siguientes familias de virus: picornavirus , flavivirus , dicystrovirus y lentivirus [2] . Además, recientemente se ha demostrado [3] la posibilidad de traducción dependiente de IRES de virus eucariotas en células bacterianas .
Los sitios internos de entrada al ribosoma fueron descubiertos en el ARNm de poliovirus y virus de la encefalomiocarditis en 1988 por los grupos de N. Sonenberg [4] y E. Wimmer [5] , respectivamente. Descubrieron que hay sitios en la molécula de ARN que pueden unirse a los ribosomas, iniciando así la traducción. Resultó que si se coloca IRES entre dos genes indicadores en el ARNm, también se expresará el segundo cistrón (terminal 3') . Sin embargo, el uso de este método (el llamado método de construcciones bicistrónicas) puede dar lugar a una serie de artefactos asociados con el empalme y la posible actividad promotora de los sitios de aterrizaje internos de los ribosomas [6] .
Todos los IRES de los picornavirus se caracterizan por la presencia de un motivo GRNA en el dominio central, que asegura la formación de una conformación de cuatro bucles , así como una pequeña región rica en pirimidina , que se encuentra 20–25 nucleótidos aguas arriba del AUG . codón _ El IRES de los flavivirus contiene 4 dominios, denominados I-IV, y en el IRES del virus de la hepatitis C (HCV), típico representante del IRES de este grupo de virus, las secuencias necesarias para la actividad del IRES se ubican entre dominios II, III y IV y captura los primeros 30 nucleótidos de la lectura de marco abierto comenzando con el codón de inicio AUG. La estructura secundaria de HCV IRES ha sido ampliamente estudiada. En particular, se encontró que el dominio II es una horquilla de 75 nucleótidos de largo con tres bucles internos y uno terminal, y que el dominio III tiene la estructura secundaria más compleja , que incluye varias hélices y horquillas. La estructura secundaria y terciaria del IRES de los dicistrovirus está bastante conservada e incluye 3 dominios distintos, cada uno de los cuales contiene un pseudonudo . Los IRES se han identificado en casi todos los miembros de la familia de los lentivirus (incluido el virus de la inmunodeficiencia humana ), y sus IRES se encuentran no solo en la 5'-UTR, sino también en la región codificante , donde están involucrados en la expresión de algunos isoformas de la principal poliproteína estructural Gag [2] .
Las estructuras de los IRES eucarióticos son muy diversas y no se han identificado secuencias o motivos conservados . En algunos casos, IRES debe ser estructuras estables en el ARNm para funcionar de manera eficaz, mientras que en otros, por el contrario, una estructura IRES demasiado rígida inhibe el inicio de la traducción. Se ha sugerido que los IRES no son estructuras rígidamente fijadas y son capaces de reorganizaciones que regulan su actividad. IRES también puede provocar la formación de diferentes isoformas de proteínas, lo que amplía aún más el número de posibles productos proteicos derivados de un solo gen [7] .
Los IRES se encuentran en las regiones 5' no traducidas de los ARNm genómicos virales y les permiten traducirse independientemente de la tapa. Varios ARNm celulares también contienen IRES [8] .
En las células, los IRES son responsables de aterrizar los ribosomas en los transcritos con o sin caperuza en los casos en los que se inhibe el inicio de la traducción dependiente de la caperuza (bajo estrés , en una determinada etapa del ciclo celular o durante la apoptosis ), y así garantizar la continuidad síntesis de las proteínas necesarias . Varios genes cuyos ARNm contienen IRES ( c-Myc , APAF1 , Bcl-2 ) se expresan poco en condiciones normales, pero en ciertas situaciones su expresión puede aumentar significativamente debido a la traducción dependiente de IRES. Se cree que IRES también puede participar en el mantenimiento de un bajo nivel de traducción de varios ARNm en condiciones normales al unirse a los ribosomas y evitar que se unan a los principales sitios de iniciación. Este mecanismo de iniciación interna es poco conocido en la actualidad, pero está claro que la eficacia de IRES depende en gran medida de factores proteicos reguladores trans que proporcionan una regulación precisa de la traducción dependiente de IRES a nivel de células individuales [1] .
Las estructuras en la 5'-UTR pueden influir en la actividad de IRES, y esta influencia puede estar mediada por interacciones tanto con varios factores transreguladores como directamente con los ribosomas. Ejemplos de genes cuyos IRES están bajo el control de proteínas reguladoras trans son los protooncogenes Myc implicados en la regulación de la proliferación celular [9] . La traducción dependiente de IRES de estos ARNm requiere factores de traducción especiales ITAF ( IRES trans-acting factores ), que actúan como chaperones de ARN , obligándolo a adoptar la conformación correcta adecuada para unirse a la subunidad 40S del ribosoma [10] .
La presencia de IRES entre AUG y otros codones de inicio (distintos de AUG) sugiere un posible papel para IRES en el inicio de la traducción a partir de codones de inicio no estándar débiles. IRES también puede interactuar con marcos de lectura cortos ( uORF ). Para probar la existencia de IRES en la estructura del ARN, no es suficiente analizar su secuencia: todas las suposiciones deben confirmarse con datos experimentales [7] .
X-linked inhibitor of apoptosis ( X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP ) juega un papel importante en la regulación de la apoptosis , por lo que su síntesis debe ser controlada con precisión. La 5'-UTR del ARNm de XIAP tiene una longitud de 1700 nucleótidos y contiene un IRES que facilita la síntesis de XIAP bajo estrés. Además del ARNm de XIAP descrito , el corte y empalme alternativo produce un ARNm con una 5'-UTR más corta de 323 nucleótidos y sin IRES. La cantidad de ARNm de XIAP con una 5'-UTR corta en las células es 10 veces mayor que con una larga. Se ha establecido que el mRNA con un 5'-UTR corto es responsable de la síntesis de XIAP en condiciones normales y se traduce por un mecanismo cap-dependiente, mientras que el mRNA con un 5'-UTR largo proporciona la síntesis de XIAP en condiciones de estrés. Por lo tanto, la combinación de 5'-UTR alternativos y mecanismos de iniciación de la traducción asegura la expresión constante de XIAP en cualquier condición [7] .
Otro ejemplo del control de la expresión génica a través de diversos elementos de la 5'-UTR es el gen del factor de crecimiento de fibroblastos humano 2 ( factor de crecimiento de fibroblastos 2, FGF-2 ) . FGF-2 se expresa en 5 isoformas diferentes resultantes del uso de codones de inicio alternativos en la 5'-UTR, y la traducción de su ARNm puede proceder no solo de forma dependiente de cap, sino también de forma dependiente de IRES. Curiosamente, la traducción de cuatro de los cinco codones de inicio está mediada por IRES. Se propone que IRES facilite la traducción de cada uno de estos cuatro codones a través de la modulación de la estructura del ARNm por factores transactivadores [7] .
En muchos virus de ARN , el inicio de la traducción se produce mediante un mecanismo independiente de la tapa con la participación de IRES localizados en la 5'-UTR [11] . Esto sucede, por ejemplo, en el VIH, los virus de la hepatitis A y C [12] . Este mecanismo de iniciación de la traducción es conveniente porque en su caso no hay necesidad de ensamblar un complejo proteico preiniciador y el virus puede multiplicarse rápidamente [13] .
Algunos ARNm virales tienen una proteína unida covalentemente ( VPg ) en el extremo 5' , por lo que el uso de iniciación dependiente de cap está excluido para ellos. El IRES del VHC forma un complejo con la subunidad 40S del ribosoma y recluta el factor de traducción de la célula huésped eIF3 [7] . Los IRES de muchos picornavirus no se unen directamente a 40S, sino que lo hacen a través del factor de iniciación eIF4G, cuyo sitio de unión de alta afinidad se encuentra en el IRES [14] . Para muchos virus (por ejemplo, picornavirus), los factores canónicos de iniciación de la traducción por sí solos no son suficientes para la iniciación dependiente de IRES: también requieren factores especiales llamados ITAF [15] . Según las características de la estructura secundaria y la necesidad de ciertos factores de traducción, los IRES se dividen en diferentes clases dentro de familias individuales de virus [16] . Por ejemplo, el IRES de los picornavirus se divide en 4 clases (I-IV) [17] .
El genoma de ARN viral puede contener más de un IRES. Por ejemplo, el virus de la parálisis del grillo , que es miembro de la familia de los dicistrovirus , tiene un genoma de ARN con dos IRES, uno de los cuales está localizado en la 5'-UTR y el otro en la región intergénica . Resultó que el funcionamiento de estos elementos es diferente: el IRES ubicado en la 5'-UTR inicia la traducción en todas las etapas de la infección viral , mientras que el IRES ubicado en la región intergénica se suprime la mayor parte del tiempo y se activa solo 2– 3 horas después de la infección. El desacoplamiento temporal de dos IRES es una estrategia viral eficaz para la expresión de determinadas proteínas durante una fase bien definida de la infección [18] .
Dado que IRES desempeña un papel fundamental en la regulación de una serie de genes, las mutaciones que afectan a IRES conducen al desarrollo de ciertas enfermedades. En particular, dichas enfermedades en humanos incluyen la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth ligada al cromosoma X , el mieloma múltiple y el síndrome del cromosoma X frágil [19] .
Los IRES virales pueden ser el objetivo de muchos medicamentos antivirales . Actualmente se están desarrollando fármacos que destruyen directamente la estructura del IRES o interfieren en la interacción del IRES con el ribosoma o factores proteicos, como los factores de iniciación de la traducción. En particular, el IRES del virus de la hepatitis C, debido a su conservadurismo entre las muestras encontradas en la clínica, puede ser blanco de fármacos que bloquean la traducción de este virus [20] . Oligonucleótidos antisentido , ácidos nucleicos peptídicos (ARN), ácidos nucleicos cerrados (LNA), oligonucleótidos de morfolina , ARN en horquilla corta , aptámeros de ARN , ribozimas , desoxirribozimas , péptidos y moléculas pequeñas [21] . Se ha demostrado que el inhibidor de la cinasa 2 de Janus AZD1480 es capaz de suprimir la reproducción del virus de la hepatitis A al bloquear su traducción dependiente de IRES [22] . La apigenina , un fármaco utilizado en el tratamiento de la fiebre aftosa , suprime el desarrollo de una infección viral al interrumpir la traducción dependiente de IRES del virus de la fiebre aftosa [23] . El ciclo de vida de los enterovirus es inhibido de manera efectiva por el fármaco anticanceroso idarubicina , que se une a IRES [24] .
De particular interés son los virus oncolíticos , cuyo ciclo de vida depende de IRES, en relación con su posible uso en la terapia contra el cáncer [25] .
IRES ha encontrado una amplia aplicación en el diseño de vectores para terapia génica . Al localizar el IRES en el ARNm de 5'-UTR de los genes requeridos , se puede lograr su expresión coordinada. En tales casos, el virus de la encefalomiocarditis IRES [26] es el más utilizado .
Para probar si una secuencia de ARN dada tiene propiedades IRES, se puede usar el siguiente método. Se crea un ARNm eucariótico bicistrónico, en el que la secuencia estudiada se ubica entre dos marcos de lectura abiertos indicadores . Un marco abierto ubicado antes de la secuencia en estudio se traducirá en una proteína mediante un mecanismo dependiente de cap. Si la secuencia estudiada tiene las propiedades de IRES, entonces la proteína correspondiente al segundo marco abierto también se acumulará en la célula [6] .
Se han desarrollado servidores web para predecir la presencia de IRES en ARN virales (VIPS) o en ARN virales y celulares (IRESPred) [27] .
En 2016, se propuso el algoritmo RNAiFold2T para el desarrollo de termómetros de ARN específicos que contienen IRES. La traslación independiente del casquete de tales elementos termo-IRES es aproximadamente un 50 % más intensa a 42 °C que a 30 °C. Sin embargo, su eficiencia de traducción sigue siendo menor que la de IRES de tipo salvaje, que no depende de la temperatura [28] .