La promiscuidad enzimática es la capacidad de una enzima para catalizar una reacción secundaria aleatoria además de su reacción principal. Aunque las enzimas son catalizadores extremadamente específicos, a menudo pueden realizar reacciones secundarias además de su actividad catalítica natural primaria [1] . La actividad secundaria de la enzima por lo general avanza más lentamente en comparación con la actividad principal y se encuentra bajo una selección neutra. Aunque normalmente estas actividades son fisiológicamente irrelevantes, bajo nuevas presiones selectivas, estas actividades pueden ser beneficiosas, provocando así la evolución de actividades previamente secundarias para convertirse en la nueva actividad primaria [2] . Un ejemplo de esto es la clorhidrolasa.atrazina ( codificado atzA ) Pseudomonas sp. , derivado de la melamina desaminasa (codificada por triA ), que tiene muy poca actividad secundaria sobre la atrazina, una sustancia química fabricada por el hombre [3] .
Las enzimas se desarrollan para catalizar una reacción específica en un sustrato específico con alta eficiencia catalítica ( k cat /KM , ver también cinética de Michaelis-Menten ). Sin embargo, además de esta actividad principal, tienen actividades secundarias, que suelen ser varios órdenes de magnitud inferiores en actividad, y que no son el resultado de la selección evolutiva y, por lo tanto, no participan en la fisiología del organismo. Este fenómeno permite que las enzimas asuman nuevas funciones, ya que las actividades secundarias pueden beneficiarse bajo nuevas presiones de selección que conducen a la duplicación del gen que codifica la enzima y la selección de la actividad secundaria como la nueva actividad primaria.
Existen varios modelos teóricos para predecir el orden de la duplicación y el cambio de especialización, pero el proceso real es más complicado y confuso (§ Enzimas reconstruidas a continuación) [4] . Por un lado, la amplificación del gen conduce a un aumento en la concentración de la enzima y a la posible ausencia de regulación restrictiva, lo que, en consecuencia, aumenta la velocidad de reacción ( v ) de la actividad secundaria de la enzima, lo que hace que sus efectos sean más pronunciados fisiológicamente ("dosificación génica"). efecto”) [5] . Por otro lado, las enzimas pueden desarrollar una mayor actividad secundaria con poca pérdida de actividad primaria ("estabilidad") con poco conflicto adaptativo (§ Estabilidad y plasticidad a continuación) [6] .
Un estudio de cuatro hidrolasas diferentes (paraoxonasa sérica humana (PON1), fosfotriesterasa de pseudomonad (PTE), proteína tirosina fosfatasa (PTP) y anhidrasa carbónica humana II (CAII)) mostró que su actividad principal es "resistente" al cambio, mientras que las actividades secundarias son "más débiles y más flexibles". En particular, la elección de actividades secundarias (a través de la evolución dirigida), no reduce inicialmente la actividad principal de la enzima (de ahí su "estabilidad"), pero afecta en gran medida las actividades secundarias (de ahí su "plasticidad") [6] .
La fosfotriesterasa (PTE) de Pseudomonas diminuta evolucionó para convertirse en de 10unaarilesterasa (hidrolasa P-O a C-O) en dieciocho ciclos, conuna [7] .
Esto significa, en primer lugar, que una enzima especializada (monofuncional) en el proceso de evolución pasa por una etapa universal (multifuncional) antes de volver a especializarse, presumiblemente después de la duplicación de genes según el modelo IAD, y, en segundo lugar, las actividades secundarias son más plásticas. diferente a la actividad principal.
El ejemplo más reciente y sorprendente de la evolución de las enzimas es la aparición de enzimas biológicamente reparadoras durante los últimos 60 años. Debido al número muy pequeño de sustituciones de aminoácidos, proporcionan un excelente modelo para estudiar la evolución de las enzimas en la naturaleza. Sin embargo, el uso de enzimas existentes para determinar cómo evolucionó una familia de enzimas tiene la desventaja de que una enzima recién evolucionada se compara con parálogos , sin conocer la verdadera identidad del ancestro antes de que los dos genes diverjan. Este problema se puede solucionar gracias a la reconstrucción de los antepasados. Propuesta por primera vez en 1963 por Linus Pauling y Emil Zuckerkandl, la reconstrucción ancestral es la derivación y síntesis de un gen a partir de la forma ancestral de un grupo de genes [8] que ha sido revivido recientemente mediante técnicas de inferencia mejoradas [9] y técnicas artificiales de bajo costo. la síntesis de genes [10] resultando en la necesidad de estudiar varias enzimas ancestrales, a las que algunos se refieren como "stemzymes" [11] [12] .
La evidencia obtenida con la enzima remodelada sugiere que el orden de los eventos cuando mejora la nueva actividad y se duplica un gen no está bien definido, al contrario de lo que sugerirían los modelos teóricos de evolución de genes.
Un estudio mostró que el gen ancestral de la familia de proteasas de defensa inmune de los mamíferos tenía una especificidad más amplia y una mayor eficiencia catalítica que la familia paráloga moderna [11] mientras que otro estudio mostró que el receptor de esteroides de vertebrados ancestrales era un receptor de estrógeno con poca ambigüedad de sustrato para otros . hormonas, lo que indica que probablemente no se sintetizaron en ese momento [13] .
Esta variabilidad en la especificidad hereditaria se ha observado no solo entre diferentes genes, sino también dentro de la misma familia de genes. A la luz de la gran cantidad de genes parálogos de α-glucosidasa fúngica con varios sustratos específicos similares a la maltosa (maltosa, turanosa, maltotriosa, maltulosa y sacarosa) y similares a la isomaltosa (isomaltosa y palatinosa), el estudio reconstruyó todos los ancestros clave y descubrió que el último ancestro común de los parálogos era principalmente activo en sustratos similares a la maltosa con solo actividad mínima para azúcares similares a la isomaltosa, aunque dio lugar a una línea de isomaltosa glucosidasas y una línea que se escindió aún más en maltosa glucosidasas e isomaltosa glucosidasas. Por el contrario, el ancestro antes de la última escisión tenía una actividad de glucosidasa similar a la isomaltosa más pronunciada [4] .
Roy Jensen en 1976 sugirió que las enzimas primarias deben ser muy promiscuas para que las redes metabólicas se ensamblen en forma de mosaico (de ahí su nombre, el modelo de mosaico ). Esta versatilidad catalítica original se perdió más tarde en favor de enzimas ortólogas especializadas altamente catalíticas. [14] Como consecuencia, muchas enzimas del metabolismo central tienen homólogos estructurales que divergieron antes de la aparición del último ancestro común universal [15] .
La promiscuidad no es solo un rasgo primordial, sino una propiedad muy común en los genomas modernos. Se llevaron a cabo varios experimentos para evaluar la distribución de la actividad enzimática de la promiscuidad en E. coli . En E. coli , 21 de los 104 genes individuales probados (de la colección Keio [16] ) podrían eliminarse mediante la sobreexpresión de una proteína de E. coli no afín (utilizando un conjunto combinado de plásmidos de la colección ASKA [17] ). Los mecanismos por los cuales un ORF no cognado puede restaurar la inactivación se pueden agrupar en ocho categorías: sobreexpresión de isoenzimas (homólogos), ambigüedad de sustrato, ambigüedad de transporte (purificación), promiscuidad catalítica, mantenimiento del flujo metabólico (incluida la sobreexpresión de un gran componente de sintasa en la ausencia de una subunidad de aminotransferasa), derivación, efectos reguladores y mecanismos desconocidos [5] . De manera similar, la sobreexpresión de la colección ORF permitió que E. coli aumentara la resistencia en más de un orden de magnitud en 86 de 237 ambientes tóxicos [18] .
Se sabe que los homólogos a veces son promiscuos en relación con las reacciones básicas de los demás [19] . Esta promiscuidad cruzada se estudia más con miembros de la superfamilia de la fosfatasa alcalina , que catalizan la reacción hidrolítica en el enlace éster sulfato, fosfonato, monofosfato, difosfato o trifosfato de varios compuestos [20] . A pesar de la divergencia, los homólogos tienen diversos grados de promiscuidad mutua: las diferencias en la promiscuidad están relacionadas con los mecanismos involucrados, especialmente el intermediario requerido [20] .
Las enzimas tienden a estar en un estado que no es solo un equilibrio entre la estabilidad y la eficiencia catalítica, sino también la especificidad y la capacidad de evolución, y los dos últimos determinan si una enzima es versátil (altamente evolucionada debido a una gran promiscuidad, pero actividad principal baja) o especial (actividad principal alta, poco desarrollada debido a la alta inteligibilidad) [21] . Algunos ejemplos son las enzimas para el metabolismo primario y secundario en las plantas (§ Metabolismo vegetal secundario a continuación). Pueden entrar en juego otros factores, por ejemplo, la glicerofosfodiesterasa ( gpdQ ) de Enterobacter aerogenes muestra diferentes valores de su actividad promiscua dependiendo de los dos iones metálicos a los que se une, según lo dicte la disponibilidad de iones [22] .v En algunos casos, la promiscuidad se puede aumentar, atenuando la especificidad del sitio activo aumentándolo con una sola mutación, como fue el caso del mutante D297G de E. coli L-Ala-D/L-Glu epimerase (ycjG ) y la enzima lactonizante E323G II mutante de muconato de Pseudomonas, lo que les permite catalizar aleatoriamente la actividad O-succinilbenzoato sintasa ( menC ) [23] . Por el contrario, la promiscuidad se puede reducir, como fue el caso de la γ-humuleno sintasa (sesquiterpeno sintasa) de Abies grandis, que se sabe que produce 52 sesquiterpenos diferentes a partir del difosfato de farnesilo después de varias mutaciones [24] .
Los estudios sobre enzimas con amplia especificidad, no promiscuas, pero relacionadas conceptualmente, como la tripsina y la quimotripsina de mamíferos y la isopropilmalato isomerasa/homoaconitasa bifuncional de Pyrococcus horikoshii , han demostrado que la movilidad del bucle del sitio activo contribuye en gran medida a la elasticidad catalítica de la enzima [25] [ 26] .
La actividad de promiscuidad es una actividad no nativa para la cual la enzima no ha evolucionado, que surge de la conformación acomodativa del sitio activo. Sin embargo, la principal actividad de la enzima no es solo el resultado de la selección hacia una alta tasa catalítica con respecto a un sustrato particular para obtener un producto particular, sino también para evitar la formación de productos tóxicos o no deseados [2] . Por ejemplo, si la síntesis de tRNA carga el aminoácido incorrecto en el tRNA, el péptido resultante tendrá propiedades inesperadamente alteradas, por lo tanto, varios dominios adicionales están presentes para mejorar la precisión [27] . Similar a la reacción de síntesis de ARNt, la primera subunidad de tirocidina sintetasa ( tyrA ) de Bacillus brevis adenila la molécula de fenilalanina para usar el resto adenilo como palanca para producir tirokidina, un péptido cíclico no ribosómico . Cuando se investigó la especificidad de la enzima, se encontró que tenía una alta selectividad por los aminoácidos naturales que no son fenilalanina, pero que toleraba mucho más los aminoácidos no naturales [28] . En particular, la mayoría de los aminoácidos no fueron catalizados, mientras que el siguiente aminoácido nativo más catalizado fue la tirosina en estructura, pero una milésima más que la fenilalanina, mientras que varios aminoácidos no codificantes catalizaron mejor que la tirosina, a saber, D-fenilalanina, β-ciclohexilo - L-alanina, 4-amino-L-fenilalanina y L-norleucina [28] .
Un caso específico de actividad secundaria seleccionada son las polimerasas y endonucleasas de restricción, donde la actividad incorrecta es de hecho el resultado de un compromiso entre precisión y capacidad de evolución. Por ejemplo, para las endonucleasas de restricción, la actividad incorrecta (actividad estrellada ) suele ser fatal para el organismo, pero una pequeña cantidad de esta actividad permite el desarrollo de nuevas funciones para contrarrestar los patógenos [29] .
Las plantas producen una gran cantidad de metabolitos secundarios debido a enzimas que, a diferencia de las involucradas en el metabolismo primario, son menos eficientes catalíticamente, pero tienen una mayor elasticidad mecánica (tipos de reacciones) y una especificidad más amplia. El umbral de deriva liberal (causado por la baja presión de selección debido al pequeño tamaño de la población) permite que la ganancia de aptitud proporcionada por un alimento apoye otras actividades, aunque pueden ser fisiológicamente inútiles [30] .
En la biocatálisis buscan muchas reacciones que no se encuentran en la naturaleza. Para ello, se identifican y desarrollan enzimas con poca actividad promiscua en relación a la reacción deseada mediante evolución dirigida o diseño racional [31] .
Un ejemplo de una enzima ampliamente desarrollada es la ω-transaminasa, que puede reemplazar una cetona con una amina quiral [32] y, por lo tanto, las bibliotecas de varios homólogos están disponibles comercialmente para la biominería rápida (por ejemplo , Codexis ).
Otro ejemplo es la posibilidad de utilizar la actividad aleatoria de la cisteína sintasa ( cysM ) hacia los nucleófilos para obtener aminoácidos no proteinogénicos [33] .
La similitud entre las reacciones enzimáticas ( EC ) se puede calcular utilizando cambios de enlace, centros de reacción o puntajes de subestructura ( EC-BLAST ) [34] .
Si bien la promiscuidad se estudia principalmente en términos de cinética enzimática estándar, la unión del fármaco y su reacción posterior es una actividad promiscua ya que la enzima cataliza una reacción de inactivación contra un nuevo sustrato que no ha evolucionado para catalizar [6] . Esto puede deberse al hecho de que las proteínas tienen solo un pequeño número de sitios distintos de unión a ligandos.
Por otro lado, el metabolismo de los xenobióticos de mamíferos ha sido diseñado para tener una amplia especificidad para oxidar, unir y eliminar compuestos lipofílicos extraños que pueden ser tóxicos, como los alcaloides de las plantas, por lo que su capacidad para desintoxicar xenobióticos antropogénicos es una extensión de esta. [35] .
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