Hibridación fluorescente in situ

La hibridación in situ con fluorescencia , o método FISH ( hibridación in situ con fluorescencia - FISH ), es un método citogenético  que se utiliza para detectar y determinar la posición de una secuencia de ADN específica en los cromosomas en metafase o en los núcleos en interfase in situ . Además, FISH se usa para detectar ARNm específicos en una muestra de tejido . En este último caso, el método FISH permite establecer características espaciotemporales de la expresión génica en células y tejidos.

El método FISH se utiliza en el diagnóstico genético preimplantacional , prenatal y posnatal [1] , en el diagnóstico de enfermedades oncológicas [2] , en dosimetría biológica retrospectiva [3] .

Sondas

La hibridación fluorescente in situ utiliza sondas de ADN (sondas de ADN) que se unen a dianas complementarias en la muestra. Las sondas de ADN contienen nucleósidos marcados con fluoróforos (marcado directo) o conjugados como biotina o digoxigenina (marcado indirecto). Con el marcado directo, la sonda de ADN unida al objetivo se puede observar con un microscopio de fluorescencia inmediatamente después de que se complete la hibridación . En el caso del marcaje indirecto, se requiere un procedimiento de tinción adicional, durante el cual se detecta biotina usando avidina o estreptavidina marcadas con fluorescencia, y digoxigenina usando anticuerpos marcados con fluorescencia . Aunque la variante indirecta del marcaje de la sonda de ADN requiere reactivos adicionales y costos de tiempo, este método generalmente permite lograr un nivel de señal más alto debido a la presencia de 3 a 4 moléculas de fluorocromo en una molécula de anticuerpo o avidina. Además, en el caso de marcaje indirecto, es posible la amplificación en cascada de la señal [4] .

Para crear sondas de ADN, se utilizan secuencias de ADN clonadas (por ejemplo, clones de unión a Noi I del tercer cromosoma humano , clones BAC ) [5] [6] , ADN genómico , productos de PCR , oligonucleótidos marcados , así como ADN, obtenido por microdisección [4] .

El marcaje de la sonda se puede realizar de varias formas, por ejemplo, por nick-translation o por PCR con nucleótidos marcados .

Procedimiento de hibridación

El primer paso es el diseño de las sondas. El tamaño de la sonda debe ser lo suficientemente grande para que se produzca la hibridación en un sitio específico, pero no demasiado grande (no más de 1 kb) para no interferir con el proceso de hibridación. Al identificar loci específicos o al teñir cromosomas completos, es necesario bloquear la hibridación de sondas de ADN con secuencias de ADN repetitivas no únicas agregando repeticiones de ADN no marcadas (por ejemplo, ADN de Cot-1 ) a la mezcla de hibridación. Si la sonda de ADN es ADN de doble cadena, debe desnaturalizarse antes de la hibridación.

En la siguiente etapa, se preparan preparaciones de núcleos en interfase o cromosomas en metafase. Las células se fijan en un sustrato, generalmente un portaobjetos de vidrio, seguido de la desnaturalización del ADN . Para preservar la morfología de los cromosomas o de los núcleos, la desnaturalización se realiza en presencia de formamida , lo que permite reducir la temperatura de desnaturalización a 70 °C.

A continuación, se añaden sondas a la preparación y se lleva a cabo la hibridación durante unas 12 horas. Luego pase varias etapas de lavados para eliminar todas las sondas no hibridadas.

La visualización de las sondas de ADN unidas se lleva a cabo utilizando un microscopio fluorescente. La intensidad de la señal fluorescente depende de muchos factores: la eficiencia de etiquetado de la sonda, el tipo de sonda y el tipo de tinte fluorescente.

Véase también

RGEN-ISL Método de imagen molecular que utiliza endonucleasa dirigida por ARN CRISPR/dCas9 asociada con una etiqueta. A diferencia de la hibridación in situ fluorescente clásica, RGEN-ISL no requiere la desnaturalización del ADN y, por lo tanto, proporciona una mejor conservación de la estructura de la cromatina.

Notas

1. ↑ Shilova N. V., Zolotukhina T. V. Hibridación in situ fluorescente en interfase en el diagnóstico de aberraciones cromosómicas numéricas // Genética médica. - 2007. - T. 6. - Nº 10. - S. 53-58.
2. ↑ Puente JA, Cushman-Vokoun AM . Diagnóstico molecular de tumores de tejidos blandos  (neopr.)  // Archives of Pathology & Laboratory Medicine . - 2011. - mayo ( vol. 135 , núm. 5 ). - S. 588-601 . -doi : 10.1043 / 2010-0594-RAIR.1 . —PMID 21526957 .
3. ↑ Ainsbury EA, Bakhanova E., Barquinero JF et al. Revisión de técnicas de dosimetría retrospectiva para exposiciones a radiaciones ionizantes externas  // Dosimetría de protección radiológica  : revista  . - 2011. - noviembre ( vol. 147 , no. 4 ). - pág. 573-592 . doi : 10.1093 / rpd/ncq499 . —PMID 21183550 . Archivado desde el original el 20 de noviembre de 2015.
4. ↑ 1 2 Rubtsov N. B. Métodos de trabajo con cromosomas de mamíferos: Proc. subsidio _ - Novosibirsk : Novosib. estado un-t , 2006. - 152 p. — ISBN 5-94356-376-8 . Archivado el 2 de abril de 2015 en Wayback Machine .
5. ↑ Sazanov AA, Sazanova AL, Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Romanov MN, Malewski T., Smirnov AF Chromosomal localization of seven HSA3q13→q23 NotI linking clones on chicken microchromosomes: orthology of GGA14 and GGA15 to a gene-rich region of HSA3  (inglés)  // Investigación citogenética y del genoma : revista. - Basilea , Suiza : Karger Publishers , 2005. - Vol. 111, núm. 2 . - Pág. 128-133. — ISSN 1424-8581 . -doi : 10.1159/ 000086381 . —PMID 16103653 . Archivado desde el original el 15 de marzo de 2015.  (Consulta: 15 de marzo de 2015)
6. ↑ Sazanov AA, Romanov MN, Sazanova AL, Korczak M., Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Smirnov AF, Jaszczak K., Dodgson JB Localización cromosómica de 15 clones BAC insertados grandes que contienen tres microsatélites en el cromosoma 4 de pollo (GGA4) que refinar su posición de centrómero  // Animal Genetics  : revista  . - Oxford , Reino Unido : Sociedad Internacional de Genética Animal; Blackwell Publishers Ltd , 2005. vol. 36, núm. 2 . - Pág. 161-163. — ISSN 0268-9146 . -doi : 10.1111 / j.1365-2052.2004.01225.x . —PMID 15771730 . Archivado desde el original el 2 de abril de 2015.  (Consulta: 15 de marzo de 2015)

Literatura

• Rubtsov N.B. Hibridación in situ de ácidos nucleicos en el análisis de anomalías cromosómicas // Métodos de genética molecular en el diagnóstico de enfermedades hereditarias y oncológicas. Introducción al Diagnóstico Molecular / Ed. M. A. Paltseva, D. V. Zaletaeva. - M .: Medicina , 2011. - T. 2. - S. 100-136. - 1000 copias.  - ISBN 978-5-225-03557-0 .

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