La electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida es un método para separar mezclas de proteínas en un gel de poliacrilamida según su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena polipeptídica o del peso molecular , así como del plegamiento de la molécula de proteína, postraduccional). modificaciones y otros factores). Este método de fraccionamiento de proteínas y péptidos se utiliza ampliamente en la biología molecular , la bioquímica y la genética modernas .
Se han desarrollado un gran número de modificaciones de la electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida para resolver diversos problemas y para diversas proteínas y péptidos. La variedad más común es la electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio según Laemmli ( SDS PAGE ) .
La movilidad electroforética de los biopolímeros en un gel depende de varios parámetros. La velocidad de migración es proporcional a la carga de la molécula, y en un líquido libre, las moléculas con la misma carga específica migran a la misma velocidad. En el caso de separación en un medio con matriz espacial rígida, la segregación se produce por fricción contra el gel. La fuerza de fricción depende de la configuración espacial de la molécula, incluido su tamaño. Así, en el caso de la separación electroforética de proteínas nativas, se observará un patrón complejo de distribución de las mismas en función de los factores anteriores.
En 1970, Laemmli propuso un método de separación electroforética de proteínas en un gel de poliacrilamida en función del peso molecular para estudiar el proceso de ensamblaje de la cápside del bacteriófago T4 [1] . Para ello, antes de aplicar el gel, las muestras se hirvieron en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 2-mercaptoetanol. Bajo la influencia del 2-mercaptoetanol , se restauran los enlaces disulfuro, lo que evita que los polipéptidos desnaturalizados se salgan y aumenten su movilidad. SDS es un detergente fuerte , su molécula consiste en una cadena lineal alifática de doce miembros y un sulfato unido covalentemente a ella, que tiene una carga negativa en solución.
Cuando se utiliza el método descrito, se hacen las siguientes suposiciones:
En estas condiciones, todos los polipéptidos tienen la misma carga específica y se separan inversamente al logaritmo de su peso molecular. La práctica confirma la corrección de estas suposiciones en la gran mayoría de los casos.
Para realizar la electroforesis desnaturalizante en PAAG , se utilizan varios sistemas tampón. El sistema predeterminado más común es el sistema de búfer Laemmli. Además, la gran mayoría de los trabajos utilizan la llamada electroforesis de disco (del inglés discontinuo - discontinuo), es decir, utilizan un gel que consta de dos partes. El gel concentrador tiene un pH de 6,8 y una concentración de poliacrilamida del 2 al 8%. El gel separador tiene un pH en la región de 8,5-9 y una concentración de poliacrilamida de 5 a 20%. La elección de la densidad del gel depende de los pesos moleculares de las proteínas estudiadas. Todos los tampones no contienen sales inorgánicas, el principal portador de corriente en ellos es la glicina . A pH 6,8, la carga total de la molécula de glicina es cercana a cero. Como resultado, para transferir cierta carga (que está determinada por la fuerza de la corriente en la celda electroforética), los complejos de polipéptidos con SDS cargados negativamente deben moverse a alta velocidad. A pH 8,8, la glicina adquiere una carga negativa, como resultado de lo cual las proteínas se inhiben bruscamente en el límite de los geles de concentración y separación (ahora hay moléculas mucho más cargadas involucradas en la transferencia de la misma carga a través de una unidad de área, por lo tanto, se mueven a menor velocidad). El resultado de esto es la concentración de proteínas en la interfaz de los geles, lo que aumenta considerablemente la resolución del método.
En un gel separador , las proteínas migran en función de la longitud de la cadena polipeptídica, es decir, inversamente proporcional al peso molecular.
Para visualizar los resultados de la electroforesis, se suele utilizar la tinción de proteínas en geles con colorante de Coomassie o plata . Para la transferencia Western , las proteínas se transfieren del gel a una membrana de nitrocelulosa.
En la mayoría de los casos, es suficiente obtener los resultados de la separación electroforética por evaluación visual del gel. Sin embargo, para obtener datos fiables y documentar adecuadamente los resultados, el gel se escanea por transmisión utilizando un densitómetro de alta sensibilidad. De hecho, un densitómetro es un escáner que pertenece a los instrumentos de control y medida y está sujeto a verificación para determinar y confirmar que las características del instrumento de medida cumplen con los requisitos establecidos. Dichos requisitos para un densitómetro permiten determinar de manera confiable no solo la posición de las proteínas en el gel, sino también la densidad óptica de la mancha de proteína. La imagen digitalizada del gel se procesa mediante un software especializado que le permite determinar de manera confiable parámetros como la movilidad electroforética de la proteína, su pureza, la cantidad de proteína en el punto, etc.
Determinación del peso molecular de proteínasLa determinación del peso molecular de la proteína en estudio requiere la necesidad de calibrar el gel por pesos moleculares. El gel se calibra frente a los pesos moleculares de las proteínas marcadoras, que se separan en paralelo con la muestra de prueba. Las mezclas de proteínas marcadoras están disponibles en varios rangos de peso. La calibración implica trazar la dependencia de la movilidad electroforética relativa (Rf) de cada una de las proteínas marcadoras en el logaritmo decimal de su peso molecular. Típicamente, la dependencia tiene la forma de una curva sigmoidea. El cálculo del peso molecular de la proteína estudiada se realiza en relación con su Rf, utilizando el método de análisis de regresión . Los resultados se consideran fiables si el rango de proteínas marcadoras es al menos el 80% de la longitud del gel de separación y la dependencia de su Rf del logaritmo del peso molecular es lineal (R 2 > 0,95). Es decir, solo se utiliza para los cálculos la sección de la curva de calibración que cubre la movilidad electroforética de la proteína en estudio.
La sensibilidad del método SDS-PAGE según Laemmli es inversamente proporcional al peso molecular de la proteína. Por ejemplo, en el rango de 10-20 kDa , es posible separar proteínas que difieren en solo 0,1 kDa (la diferencia es solo un residuo de aminoácido ). Sin embargo, para obtener resultados satisfactorios se deben seguir unas sencillas recomendaciones metodológicas. Así, debido a que la alta conductividad eléctrica de las muestras en estudio puede distorsionar significativamente la movilidad electroforética de la proteína, su fuerza iónica debe ser lo más baja posible y aproximadamente igual. Otra condición importante para la fiabilidad de la determinación del peso molecular es la carga óptima de la proteína en el gel. Al teñir con Coomassie Blue R250, el contenido óptimo de proteínas en una mancha debe estar en el rango de 0,1-1 µg y al menos un orden de magnitud menor cuando se tiñe con plata. De lo contrario, las proteínas del gel formarán manchas anchas, lo que dificultará la determinación de su movilidad electroforética. A pesar de la alta sensibilidad y la simplicidad del método, el peso molecular de las proteínas determinado mediante SDS-PAGE a menudo difiere del valor real. La diferencia puede variar desde unos pocos kDa para proteínas de bajo peso molecular hasta decenas de kDa para proteínas de alto peso molecular.
Cuantificación de proteínasEl método SDS-PAGE es indispensable si es necesario cuantificar una proteína individual en una muestra que es compleja no solo en la composición proteica. Un ejemplo de tal muestra serían extractos crudos o lisados celulares. En este caso, el método es adecuado para estudiar tanto proteínas nativas como proteínas que han cambiado de estructura. Tales proteínas pueden ser polímeros, agregados o moléculas completamente desnaturalizadas. La naturaleza relativamente poco exigente del método con respecto a la composición de la muestra y el estado estructural de las proteínas en ella distingue favorablemente SDS-PAGE de otros métodos de determinación cuantitativa, por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución o inmunoensayo enzimático.
La cuantificación de proteína usando SDS-PAGE sugiere la necesidad de calibrar el gel en relación con la dependencia de la intensidad del color de la mancha de proteína en el gel de la cantidad de proteína en esta mancha. Para ello, en paralelo a las muestras estudiadas, se separan en el gel varias muestras de referencia con diferentes cantidades de la proteína de referencia conocidas con precisión. Después de la visualización de las proteínas en el gel utilizando un densitómetro, se mide la densidad de cada punto de proteína de las muestras de referencia. Determine la dependencia de esta densidad con la cantidad de proteína. El gel calibrado se utiliza para calcular la cantidad de proteína en estudio en relación con la densidad de su punto, utilizando el método de análisis de regresión . Se consideran resultados fiables si la dependencia de la densidad de manchas de proteína para la proteína de referencia de la cantidad de proteína en la mancha es lineal (R 2 > 0,95). Es decir, para los cálculos se utiliza únicamente aquella sección de la curva de calibración que cubre la densidad de la mancha de la proteína en estudio. Cabe señalar que la selección de la concentración de proteína óptima en la muestra de prueba se lleva a cabo empíricamente.
Al cuantificar proteínas mediante SDS-PAGE, debe tenerse en cuenta una característica importante de este método. Entonces, debido a que la eficiencia de colorear una proteína en un gel depende de su naturaleza, por ejemplo, composición de aminoácidos, peso molecular, presencia de grupos prostéticos , la proteína de referencia utilizada para calibrar el gel y la proteína en estudio deben ser idéntico. En caso de desviación de esta regla, la diferencia entre el monto real y recibido puede diferir varias veces.
Determinación de impurezas proteicasEl método SDS-PAGE según Laemmli permite cuantificar el contenido de sólo aquellas impurezas que difieren en su peso molecular del peso molecular de la proteína en estudio. Para hacer esto, la muestra de prueba se separa en un gel en paralelo con una o más muestras de referencia, la cantidad de proteína de referencia en la que es comparable a la cantidad esperada de impurezas en la solución de proteína de prueba. Por ejemplo, si la concentración de proteína en la muestra de prueba es de 1 mg/ml, y la cantidad esperada de impurezas en ella está dentro del 1%, entonces se usa como referencia al menos una solución de proteína de referencia con una concentración de 10 µg/ml. muestra. Después de la visualización de las proteínas en el gel con un densitómetro, se mide la densidad de cada mancha de proteína para la muestra de prueba y la muestra de referencia.
El método SDS-PAGE es adecuado para la determinación de dímeros y polímeros de proteínas que se acumulan debido al cierre espontáneo de enlaces disulfuro intermoleculares , por ejemplo, durante el almacenamiento inadecuado del fármaco. Para ello, la proteína en estudio y la proteína de referencia se separan en un gel en condiciones reductoras y no reductoras. Las impurezas son dímeros y polímeros si se detectan en condiciones reductoras y no se detectan en condiciones no reductoras. En este caso, su peso molecular debe ser un múltiplo del peso molecular de la proteína analizada. Así, la evaluación de la pureza de una preparación proteica por SDS-PAGE en condiciones reductoras permite determinar únicamente las impurezas proteicas no homólogas.
Los resultados de determinar la pureza de una muestra pueden ser semicuantitativos o cuantitativos. En el caso de que se realice una comparación de la densidad de manchas de proteínas contaminantes respecto a una mancha de una proteína de referencia, el resultado obtenido es semicuantitativo. Su redacción puede sonar, por ejemplo, de la siguiente manera: "El contenido de impurezas proteicas en la solución de prueba no supera el 1%". La determinación cuantitativa de impurezas proteicas se realiza de acuerdo con las recomendaciones para la determinación cuantitativa de proteínas por el método SDS-PAGE.
Además de los enfoques descritos, algunos laboratorios practican un método para determinar la homogeneidad de una preparación sin usar muestras de referencia. En este caso, la pureza de la proteína en estudio viene determinada por la densidad de la mancha en el gel, que se estima como un porcentaje de la suma de las densidades de todas las manchas de proteína identificadas. Este enfoque no refleja la cantidad real de impurezas, pero puede servir como una evaluación cualitativa de la pureza de la droga. El método no puede clasificarse como cuantitativo debido al hecho de que el número y la densidad de las manchas de proteína detectadas son directamente proporcionales a la cantidad de proteína total en la muestra de prueba y la sensibilidad del método para determinar las proteínas en el gel. Además, la dependencia de la densidad de una mancha de proteína de la cantidad de proteína que contiene en un rango que excede un orden de magnitud a menudo no es lineal.
Para la electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida se utilizan las siguientes soluciones tampón : Tris - HCl , Tristricin , TBE , TBE con urea, Bis-Tris.