La transferencia Western (western blot, inmunotransferencia de proteínas, ing. Western blot ) es un método analítico utilizado para determinar proteínas específicas en una muestra . El primer paso utiliza la electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida para separar los polipéptidos desnaturalizados por longitud (generalmente en presencia de SDS ) o estructura tridimensional de la proteína (en el estado nativo). A continuación, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o PVDF y luego se detectan utilizando anticuerpos específicos para una proteína determinada [1] [2] .
Hay muchas empresas comerciales que se especializan en la producción de anticuerpos (tanto monoclonales como policlonales ) para decenas de miles de proteínas diferentes [3] .
El Western Blot se utiliza en biología molecular , bioquímica , genética y otras disciplinas de las ciencias naturales.
Otros métodos similares utilizan anticuerpos para detectar proteínas en tejidos y células mediante inmunotinción y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ( ELISA ) .
La transferencia Western se desarrolló en el laboratorio de George Stark en Stanford . El nombre Western Blot fue dado a la técnica por W. Neal Burnette [4] y es un juego de palabras del nombre Southern Blot , una técnica de detección de ADN desarrollada previamente por Edwin Southern . Un método similar para determinar el ARN se denomina transferencia del norte , la detección de modificaciones de proteínas postraduccionales se denomina transferencia del este .
La muestra se puede tomar de tejido completo o de cultivo celular. En la mayoría de los casos, los tejidos duros se muelen primero con una licuadora (para muestras de gran volumen), un homogeneizador (volúmenes más pequeños) o sonicación . Al mismo tiempo, las bacterias, los virus y otros componentes ambientales también son fuente de proteínas.
Se pueden usar varios detergentes , sales y tampones para mejorar la lisis celular y la disolución de proteínas . Los inhibidores de proteasa y fosfatasa a menudo se agregan para evitar que las muestras sean digeridas por sus propias enzimas . La preparación del tejido se suele realizar a bajas temperaturas para evitar la desnaturalización de las proteínas .
Se utilizan combinaciones de técnicas de fraccionamiento bioquímico y mecánico, incluidos varios tipos de filtración y centrifugación , para separar diferentes compartimentos celulares y orgánulos .
Las proteínas se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La separación de proteínas se puede realizar por punto isoeléctrico (pI), peso molecular , carga eléctrica o una combinación de estos parámetros.
El método más común para separar proteínas es la electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio ( SDS ) según Laemmli . [5] El SDS provoca la desnaturalización de las proteínas y las mantiene en un estado desnaturalizado; los agentes reductores de los enlaces disulfuro, como el ditiotreitol y el mercaptoetanol , se utilizan para destruir las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas . Los polipéptidos desnaturalizados migran en el campo eléctrico a través del gel de acrilamida hacia el ánodo , y las proteínas más pequeñas se mueven más rápido y, por lo tanto, se separan según el peso molecular. La concentración de acrilamida determina la resolución del gel: cuanto mayor sea la concentración de acrilamida, mejor será la resolución de las proteínas de bajo peso molecular. Una baja concentración de acrilamida mejora la resolución de las proteínas de alto peso molecular. También es posible utilizar electroforesis bidimensional (2-D) . En este caso, la separación de las proteínas se realiza en dos sentidos, según su punto isoeléctrico en el primer sentido y según el peso molecular, en el segundo.
Las muestras en el gel se aplican a los bolsillos. Por regla general, una de las "pistas" se deja para los marcadores de peso molecular (mezclas de proteínas con masas conocidas). Después de aplicar el voltaje, las proteínas se mueven en el campo eléctrico a diferentes velocidades. Las diferencias en la velocidad de avance -movilidad electroforética- conduce a la separación de las proteínas en bandas ( bandas inglesas ).
Para que las proteínas estén disponibles para los anticuerpos y la detección posterior, se transfieren junto con una tira de gel a una membrana hecha de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno ( PVDF ) . La membrana se aplica sobre el gel y se coloca encima una pila de papel de filtro. Toda la pila se coloca en el tampón de transferencia, que, bajo la acción de la acción capilar, sube por el papel, llevándose consigo las proteínas. Otro método de transferencia de proteínas se llama electrotransferencia y utiliza una corriente eléctrica para transferir proteínas del gel a la membrana. Las proteínas se mueven del gel a la membrana manteniendo su ubicación. Como resultado de este proceso de "transferencia" (del inglés blotting ), las proteínas se retienen en una fina capa superficial de la membrana de detección. Ambas variantes de membrana se utilizan debido a sus propiedades de unión a proteínas no específicas. La unión a proteínas se basa tanto en las interacciones hidrofóbicas como en las interacciones electrostáticas entre la membrana y la proteína. La membrana de nitrocelulosa es más barata que la de PVDF, pero es mucho más frágil y menos resistente al reetiquetado.
La uniformidad y la eficacia global de la transferencia de proteínas del gel a la membrana se pueden comprobar tiñendo la membrana con azul de Coomassie o tinción de Ponceau S. Coomassie es el más común de los dos, mientras que Ponceau S es más sensible y soluble en agua, lo que facilita la limpieza posterior y el etiquetado de la membrana. [6]
Una vez que se ha seleccionado una membrana por su capacidad para unirse a proteínas, se han seleccionado los anticuerpos y la proteína diana, se debe tener cuidado para evitar la interacción entre la membrana y el anticuerpo utilizado para detectar la proteína diana (porque el anticuerpo en sí mismo es una proteína). El bloqueo de la unión no específica se logra colocando la membrana en una solución de proteína diluida, generalmente albúmina de suero bovino o leche en polvo sin grasa (ambas económicas), con un pequeño porcentaje de un detergente como Tween 20 o Triton X-100 . La proteína de la solución diluida se adhiere a la membrana en todos los lugares donde la proteína diana no se ha adherido. Por lo tanto, cuando se agregan anticuerpos, el único lugar libre en la membrana donde pueden unirse son los sitios de unión en proteínas diana específicas. Este "ruido" de fondo en el western blot final da como resultado resultados limpios y la eliminación de falsos positivos.
Durante el proceso de detección, la membrana se "marca" con la proteína de interés con un anticuerpo modificado que se une a una enzima informadora que se mantiene en un soporte adecuado, lo que lleva a una reacción colorimétrica y da color. Por varias razones, la detección se lleva a cabo en dos pasos, aunque ahora está disponible un método de detección de un solo paso para ciertas aplicaciones.
Los anticuerpos se producen al exponer una clase de huésped o un cultivo de células inmunitarias a alguna proteína (o parte de ella). Esto suele ser parte de la respuesta inmunitaria, pero aquí (en el ensayo) los anticuerpos recogidos se utilizan como una herramienta de detección específica y sensible que se une directamente a la proteína.
Después del bloqueo, la solución de anticuerpo primario diluida (normalmente entre 0,5 y 5 µg/ml) se incuba con la membrana y se agita suavemente. Por lo general, la solución consiste en una solución salina tamponada con un pequeño porcentaje de detergente, a veces leche en polvo o BSA. La solución de anticuerpo y la membrana se pueden cerrar juntas e incubar desde 30 minutos hasta toda la noche. También se pueden incubar a diferentes temperaturas; a temperaturas elevadas, se observa una mejor unión, tanto específica (de la proteína diana, "señal1") como no específica ("ruido").
Después de enjuagar la membrana para eliminar los anticuerpos primarios no unidos, la membrana se expone a otros anticuerpos que se unen directamente a las regiones específicas de clase de los anticuerpos primarios. Estos se conocen como anticuerpos secundarios y, de acuerdo con sus propiedades diana, se denominan comúnmente "anti-ratón", "anti-cabra", etc. Los anticuerpos se obtienen de una fuente animal (o fuentes animales de cultivo de hibridomas ); Los anticuerpos secundarios anti-ratón se unirán a la mayoría de los anticuerpos primarios derivados de ratón. Esto genera algunos ahorros al permitir que un laboratorio individual use una sola fuente de producción masiva de anticuerpos y conduce a resultados mucho más reproducibles. Los anticuerpos secundarios generalmente se unen a la biotina oa una enzima informadora , como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante . Esto significa que varios anticuerpos secundarios pueden unirse a uno primario y amplificar la señal.
Los anticuerpos secundarios relacionados con la peroxidasa de rábano picante más comunes se utilizan para cortar el agente quimioluminiscente, y el producto de reacción produce radiación luminiscente en proporción a la cantidad de proteína. Se coloca una hoja de película fotográfica fotosensible contra la membrana y se expone a la radiación de reacción, creando una imagen de las bandas de anticuerpos en la transferencia. Un enfoque más económico pero menos sensible que usa tinción de 4-cloronaftol mezclada con peróxido de hidrógeno al 1% ; la reacción del radical peróxido con 4-cloronaftol da un color marrón oscuro, que se registra sin el uso de una película fotográfica especial.
Al igual que con ELISPOT y ELISA , la enzima se puede proporcionar con una molécula de sustrato que la enzima convierte en un producto de reacción coloreado que será visible en la membrana (consulte la figura con bandas azules a continuación).
Otro método de detección de anticuerpos secundarios utiliza anticuerpos con un fluoróforo unido que emite en el infrarrojo cercano (NIR). La luz emitida por el colorante fluorescente es constante y hace que la detección de fluorescencia sea una forma más precisa y sensible de medir la diferencia en la señal producida por las proteínas marcadas con anticuerpos en un Western blot. Las proteínas se pueden cuantificar ya que la señal se calcula como la diferencia (radiación) en relación con todas las proteínas en la membrana, medidas en reposo, a la (radiación) de quimioluminiscencia, que se mide dinámicamente. [7]
Un tercer método alternativo utiliza un marcador radiactivo en lugar de una enzima unida a un anticuerpo secundario, tal como la proteína de unión al anticuerpo de tipo A de la proteína A de Staphylococcus marcada con un isótopo radiactivo de yodo. Otros métodos son más seguros, rápidos y baratos, por lo que rara vez se utiliza la detección radiactiva.
Históricamente, el proceso de marcaje se ha llevado a cabo en dos pasos porque es relativamente más fácil producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto brinda a los investigadores y empresas una gran ventaja en términos de flexibilidad y agrega un paso de amplificación al proceso de detección. Dado el advenimiento de los ensayos de proteínas de alto rendimiento y los umbrales de detección bajos, todavía hay interés en desarrollar un sistema de etiquetado de un solo paso que permita que el proceso se ejecute más rápido y a un costo menor. Este (un sistema de un solo paso) requiere etiquetas de anticuerpos que reconozcan la proteína en estudio y, al mismo tiempo, lleven un marcador para la detección: las etiquetas más accesibles para las "colas de proteínas" conocidas. Primero, las etiquetas se incuban con una membrana de estilo de dos pasos con anticuerpos primarios y luego están listas para la detección directa después de una serie de lavados.
Después de lavar las etiquetas no unidas, el Western blot está listo para detectar sondas unidas a la proteína objetivo. En la práctica, no todos los westerns muestran proteínas con una sola banda en la membrana. El tamaño aproximado se calcula comparando las bandas teñidas con marcadores de peso molecular agregados por electroforesis. El proceso se repetirá con proteínas estructurales como actina o tubulina que no cambian entre experimentos. La cantidad de proteína diana depende de la cantidad de proteína estructural de control entre grupos. Esta técnica proporciona una corrección de la cantidad de proteína total en la membrana en caso de error o transferencia incompleta.
El método de detección colorimétrica se basa en la incubación de un Western blot con un sustrato que reacciona con una enzima indicadora (como la peroxidasa de rábano picante ) , "asentándose" en un anticuerpo secundario . El colorante soluble cambia a una forma insoluble de un color diferente, precipitando junto a la enzima y tiñendo la membrana. El crecimiento de las manchas se limita lavando el tinte soluble. El nivel de proteína se evalúa densitométricamente por intensidad de tinción o espectrofotométricamente .
El método de detección quimioluminiscente se basa en la incubación de una membrana de nitrocelulosa con un sustrato que se ilumina después de la interacción con un indicador de anticuerpo secundario. La luz es registrada por una película fotográfica o una cámara CCD , que captura digitalmente un Western blot. La imagen se analiza densitométricamente , estimando la cantidad relativa de proteína teñida y dando un resultado cuantitativo en unidades de densidad óptica. El nuevo software permite realizar más análisis de datos, como la determinación del peso molecular, si se ha utilizado un estándar adecuado.
Las etiquetas radiactivas no requieren sustratos enzimáticos, pero permiten colocar una película radiográfica médica frente a un Western blot, lo que permite que esta (la película) interactúe con las etiquetas y cree áreas oscuras que corresponden a las bandas de la proteína en estudio (en la imagen de la derecha). La demanda de métodos de detección radiactiva está disminuyendo debido a su alto costo, altos riesgos para la salud y la seguridad, y alternativas proporcionadas por ECL.
Las etiquetas fluorescentes se excitan con la luz y emiten luz de longitud de onda más larga, que es detectada por fotosensores como una cámara CCD equipada con filtros de emisión apropiados. La cámara toma una fotografía digital del western blot, lo que permite un análisis posterior de los datos adquiridos, como el análisis del peso molecular y el análisis cuantitativo de western blot.