Sistemas de secreción tipo III ( ing. Sistema de secreción tipo tres , abreviado T3SS ), también sistema secretor tipo III o inyectosoma (la llamada jeringa molecular ), uno de varios tipos de sistemas de secreción bacterianos , es un complejo proteico (a veces considerado como un orgánulo ), que ocurre en algunas bacterias Gram-negativas [1] .
En las bacterias patógenas , la estructura en forma de aguja se utiliza como sonda sensorial para detectar la presencia de células de organismos eucariotas y liberar proteínas que ayudan a las bacterias a infectarlos. Las proteínas efectoras secretadas viajan directamente de la célula bacteriana a la célula eucariota (célula huésped) [2] , donde tienen una serie de efectos que ayudan al patógeno a sobrevivir y evitar una respuesta inmunitaria .
El término sistema de secreción de tipo III se introdujo en 1993 [3] . Este sistema de secreción difiere de al menos otros cinco sistemas de secreción que se encuentran en las bacterias Gram-negativas. Muchas bacterias asociadas con animales y plantas tienen T3SS similares. Los datos de T3SSs son similares como resultado de la evolución divergente, y los análisis filogenéticos respaldan un modelo en el que las bacterias gramnegativas pueden transmitir el casete del gen T3SS móvil horizontalmente a otras especies. Las especies de T3SS más estudiadas son las de Shigella (provoca disentería bacilar ), Salmonella ( fiebre tifoidea ), Escherichia coli ( microflora intestinal , algunas cepas provocan intoxicación alimentaria ), Vibrio ( gastroenteritis y diarrea ), Burkholderia ( saps ), Yersinia ( plaga ) , Chlamydia ( clamidia , ETS ), Pseudomonas (afecta a humanos, animales y plantas) y los patógenos de plantas Erwinia , Ralstonia y Xanthomonas , así como el simbionte de plantas Rhizobium .
T3SS está compuesto por aproximadamente 30 proteínas diferentes, lo que lo convierte en uno de los sistemas de secreción más complejos. Su estructura es similar a los flagelos bacterianos (estructuras extracelulares largas y rígidas utilizadas para la motilidad). Algunas de las proteínas involucradas en T3SS comparten homología de secuencia de aminoácidos con proteínas flagelares. Algunas bacterias que tienen T3SS también tienen flagelos y son móviles (como Salmonella ), mientras que otras no (como Shigella ). Técnicamente hablando, el sistema de secreción de tipo III se utiliza para eliminar tanto las proteínas asociadas a la infección como los componentes flagelares. Sin embargo, el término "sistema de secreción de tipo III" se utiliza principalmente en relación con el aparato infeccioso. El flagelo bacteriano comparte un ancestro común con este sistema secretor [4] [5] .
Los T3SS son esenciales para la patogenicidad (capacidad de infectar) de muchas bacterias patógenas. Los defectos en T3SS pueden hacer que dichas bacterias no sean patógenas. Se ha sugerido que algunas cepas no invasivas de bacterias Gram-negativas perdieron T3SS porque no se utilizó un sistema energéticamente desventajoso (caro) [6] . Si bien los antibióticos tradicionales han sido efectivos contra estas bacterias en el pasado, constantemente surgen nuevas cepas resistentes a los antibióticos. Comprender cómo funciona T3SS y desarrollar fármacos específicamente para este sistema ha sido un objetivo importante de muchos grupos de investigación de todo el mundo desde finales de la década de 1990.
| Sistema de secreción tipo III | |
|---|---|
| Complejo de agujas T3SS | |
| Identificadores | |
| Símbolo | T3SS |
| TCDB | 1.B.22 |
| superfamilia OPM | 348 |
| Proteína OPM | 5tcq |
Una característica distintiva de T3SS es la llamada aguja [7] [8] (más generalmente, complejo de aguja , abreviatura NC ) o aparato T3SS ( ing . T3SS aparato , abreviatura T3SA ), también llamado inyectosoma cuando la ATPasa está inactiva ((off); ver más abajo. Las proteínas bacterianas que se secretan pasan del citoplasma bacteriano a través de la aguja directamente al citoplasma de la célula huésped. Tres membranas separan los dos citoplasmas: la membrana doble (membrana interna y externa) de Gram-negativo Las bacterias y los eucariotas La aguja permite un paso suave a través de estas membranas altamente selectivas y casi impermeables. Una bacteria puede tener varios cientos de complejos de agujas distribuidos sobre las superficies de sus membranas. Se ha sugerido que el complejo de agujas es una característica universal de todas las bacterias patógenas T3SS [ 9] .
El comienzo del complejo de la aguja se encuentra en el citoplasma de la bacteria, atraviesa dos membranas y sobresale de la célula. El ancla del complejo ubicado en la membrana es la base (o cuerpo basal ) de T3SS. La parte extracelular es la aguja. La llamada varilla interior conecta la aguja a la base. La aguja en sí, aunque es la parte más grande y más visible del T3SS, está formada por muchas unidades de una sola proteína. Por lo tanto, la mayoría de las diferentes proteínas T3SS son las que forman parte de la base y las que se secretan en la célula huésped. Como se mencionó anteriormente, el complejo de agujas es similar a los flagelos bacterianos . Más específicamente, la base del complejo de agujas es estructuralmente muy similar a las bases de los flagelos; La aguja en sí es análoga al gancho flagelar, la estructura que conecta la base con el filamento flagelar [10] [11] .
La base consta de varios anillos circulares y es la primera estructura construida en el nuevo complejo acicular. Una vez que se completa la construcción de la base, sirve como una máquina molecular para la secreción de proteínas externas (es decir, una aguja). Después de completar todo el complejo, el sistema cambia a la secreción de proteínas destinadas a la entrega a las células huésped. Se supone que la aguja se construye de abajo hacia arriba; las unidades de los monómeros de proteína de la aguja se apilan una encima de la otra, de modo que la unidad en la punta de la aguja se agrega en último lugar. La subunidad de la aguja es una de las proteínas T3SS más pequeñas y mide alrededor de 9 kDa. La aguja consta de 100-150 subunidades.
La aguja T3SS tiene entre 60 y 80 nm de largo y 8 nm de ancho en la parte exterior. La aguja debe ser lo más corta posible para que otras estructuras bacterianas extracelulares (p. ej., adhesinas y capa de lipopolisacárido ) no interfieran con la secreción. El agujero de la aguja tiene un diámetro de 3 nm. La mayoría de las proteínas efectoras plegadas son demasiado grandes para ser transportadas a través de la abertura de la aguja, por lo que la mayoría de las proteínas secretadas deben pasar a través de la aguja desplegada, tarea que realiza la ATPasa ubicada en la base de la estructura [12] .
Las proteínas T3SS se pueden agrupar en tres categorías:
La mayoría de los genes T3SS se encuentran en operones . Estos operones se encuentran en nucleoides en algunas especies bacterianas y en plásmidos aislados en otras especies. Salmonella, por ejemplo, tiene una región cromosómica en la que se ensamblan la mayoría de los genes T3SS, la denominada isla de patogenicidad de Salmonella ( inglés Salmonella patogenicity island , abreviatura SPI ). Shigella , por otro lado, tiene un gran plásmido virulento que contiene todos los genes T3SS. Muchas islas de patogenicidad y plásmidos contienen elementos que permiten la transferencia horizontal frecuente del gen del islote o del plásmido a una nueva especie.
El sistema debe reconocer las proteínas efectoras que se secretarán a través de la aguja, ya que flotan en el citoplasma junto con miles de otras proteínas. El reconocimiento se lleva a cabo mediante una señal de secreción : una secuencia de aminoácidos corta ubicada al comienzo (N-terminal) de la proteína (generalmente incluye los primeros 20 aminoácidos), que el complejo de la aguja puede reconocer. A diferencia de otros sistemas de secreción, la señal de secreción de las proteínas T3SS nunca se escinde de la proteína.
El contacto de la aguja con la célula huésped desencadena la activación de T3SS [13] ; se sabe poco sobre este mecanismo desencadenante (ver más abajo). También se puede inducir la secreción reduciendo la concentración de iones de calcio en el medio de cultivo (para Yersinia y Pseudomonas ; se añaden moléculas quelantes como EDTA o EGTA) y añadiendo al medio de cultivo el colorante aromático rojo Congo (por ejemplo, para Shigella ). Estos y otros métodos se utilizan en laboratorios para estimular artificialmente el sistema de secreción tipo III.
La inducción de la secreción por señales externas distintas del contacto con las células huésped también se produce in vivo en organismos infectados. Las bacterias detectan señales como la temperatura , el pH , la osmolaridad y la concentración de oxígeno y las utilizan para "decidir" si activar o no su T3SS. Por ejemplo, la salmonela puede multiplicarse mejor y entrar en el íleon , en lugar del ciego del animal . Las bacterias pueden saber dónde están debido a los diversos iones presentes en estas regiones; el íleon contiene aniones formiato y acetato, mientras que el ciego no. Las bacterias detectan estas moléculas, determinan que están en el íleon y activan su mecanismo de secreción. Las moléculas presentes en el ciego, como el propionato y el butirato, tienen un efecto negativo sobre las bacterias e inhiben la secreción. El colesterol , que se encuentra en la mayoría de las membranas de las células eucariotas, es capaz de inducir la secreción en Shigella.
Las señales externas enumeradas anteriormente regulan la secreción directamente o mediante un mecanismo genético. Se sabe que varios factores de transcripción regulan la expresión de los genes T3SS. Algunas de las chaperonas que se unen a los efectores T3SS también actúan como factores de transcripción. Se ha propuesto un mecanismo de retroalimentación: cuando una bacteria no secreta, sus proteínas efectoras se unen a las chaperonas y flotan en el citoplasma. Cuando comienza la secreción, las chaperonas se separan de los efectores, y estos últimos se secretan y abandonan la célula. Las chaperonas solitarias luego actúan como factores de transcripción uniéndose a los genes que codifican sus efectores e induciendo su transcripción y produciendo así más efectores.
Se han propuesto estructuras similares a los inyectosomas de tipo 3SS in vivo como remaches de membranas externas e internas bacterianas Gram-negativas que ayudan en la liberación de vesículas de la membrana externa destinadas a entregar secreciones bacterianas a las células huésped eucariotas u otras células objetivo [14] .
Los efectores T3SS ingresan al complejo de agujas en la base y pasan a través de la aguja hacia la célula huésped. La manera exacta en que los efectores ingresan a la célula huésped es poco conocida. Anteriormente se ha sugerido que la propia aguja es capaz de perforar un agujero en la membrana de la célula huésped; esta teoría ha sido desacreditada. Ahora está claro que algunos efectores, los llamados translocadores , se secretan primero y producen un poro o canal ( translocon ) en la membrana de la célula huésped a través del cual pueden entrar otros efectores. Las bacterias mutadas deficientes en translocadores pueden secretar proteínas pero no pueden entregarlas a las células huésped. En general, cada T3SS incluye tres translocadores. Algunos translocadores tienen una doble función; luego de participar en la formación de los poros, se trasladan al interior de la célula y actúan como verdaderos efectores.
Los efectores T3SS manipulan las células huésped de varias maneras. El efecto más llamativo es la estimulación de la absorción de la bacteria por parte de la célula huésped. Muchas bacterias que poseen T3SS deben ingresar a las células huésped para replicarse y proliferar. Los efectores que introducen en la célula huésped inducen al huésped a engullir la bacteria y prácticamente “comerla”. Para que esto suceda, los efectores bacterianos manipulan el mecanismo de polimerización de actina de la célula huésped . La actina es un componente del citoesqueleto y también participa en la motilidad celular y los cambios de forma. A través de sus efectores T3SS, la bacteria puede utilizar la propia maquinaria de la célula huésped para su propio beneficio. Una vez que una bacteria ha entrado en una célula, puede secretar más fácilmente otros efectores y entrar en las células vecinas, infectando así rápidamente todo el tejido.
También se ha demostrado que los efectores T3SS influyen en el ciclo de la célula huésped y algunos de ellos pueden inducir la apoptosis . Uno de los efectores T3SS más estudiados es IpaB de Shigella flexneri . Desempeña un papel doble, como translocador, creando poros en la membrana de la célula huésped, y como efector, ejerciendo muchos efectos negativos sobre la célula huésped. Se ha demostrado que IpaB induce la apoptosis en macrófagos , células del sistema inmunitario animal, después de ser captado por ellos [15] . Posteriormente, se demostró que IpaB lograba esto al interactuar con la caspasa 1 , una importante proteína reguladora en las células eucariotas [16] .
Otra clase bien caracterizada de efectores T3SS son los activadores de tipo activador de la transcripción (efectores TAL) en Xanthomonas . Cuando se introducen en las células vegetales, estas proteínas pueden ingresar al núcleo de la célula vegetal, uniéndose a secuencias promotoras y activando la transcripción de genes vegetales que ayudan con la infección bacteriana [17] . Recientemente se ha demostrado que el reconocimiento del ADN efector TAL incluye un código simple [18] [19] , lo que ha mejorado enormemente la comprensión de cómo estas proteínas pueden alterar la transcripción génica en las células de la planta huésped.
Desde mediados de los noventa se han publicado cientos de artículos sobre T3SS. Sin embargo, numerosos problemas relacionados con el sistema siguen sin resolverse:
Desde principios de la década de 1990, se han encontrado nuevas proteínas T3SS en varias especies bacterianas a un ritmo constante. Las abreviaturas se han dado de forma independiente para cada serie de proteínas en cada organismo, y los nombres no suelen revelar muchas de las funciones de la proteína. Más tarde se demostró que algunas proteínas que se encuentran de forma independiente en diferentes bacterias son homólogas; los nombres históricos, sin embargo, han sobrevivido en gran medida, lo que puede generar confusión. Por ejemplo, las proteínas SicA, IpgC y SycD son homólogas de Salmonella , Shigella y Yersinia , respectivamente, pero la última letra ("número de serie") de su nombre no indica este fenómeno.
El siguiente es un resumen de los nombres de series de proteínas más comunes en varias especies que contienen T3SS. Tenga en cuenta que estos nombres incluyen proteínas que forman el mecanismo T3SS, así como proteínas efectoras secretadas:
Estas abreviaturas van seguidas de una letra o un número. Las letras generalmente indican el "número de serie", ya sea el orden cronológico de descubrimiento o el orden físico en el que apareció el gen en el operón. Los números, en un caso más raro, indican el peso molecular de la proteína en kDa. Ejemplos: IpaA, IpaB, IpaC; MxiH, MxiG, MxiM; Spa9, Spa47.
Varios elementos clave aparecen en todos los T3SS: el monómero de la aguja, el eje interno de la aguja, proteínas circulares, dos translocadores, la proteína de la punta de la aguja, una proteína lineal (que se cree que determina la longitud de la aguja; ver arriba) y ATPasa, que suministra energía para la secreción. La siguiente tabla enumera algunas de estas proteínas clave en cuatro bacterias que contienen T3SS:
| ↓ Funciones / Género → | Shigela | Salmonela | Yersinia | Escherichia |
|---|---|---|---|---|
| monómero de aguja | MxiH | PrgI | YscF | ESCF |
| Varilla interior | MxiII | PrgJ | YSCI | ESCI |
| Proteína de punta de aguja | iPad | SipD | LcrV | España |
| translocador | IpaB | SipB | YopB | EspD |
| translocador | IpaC | SipC | YopD | EspB |
| Acompañante de dos translocadores | IpgC | Sica | SycD | CesD |
| ATPasa | spa47 | InvC | YscN | SepB (EscN) |
| Proteína lineal | spa32 | InvJ | YscP | Orf16 |
| Cambiar | balneario40 | balnearios | YscU | escu |
| Portero | México | inversión | YopN (TyeA) | SepL |
El aislamiento de estructuras de membrana hidrofóbicas grandes y frágiles de las células ha sido un problema durante muchos años. Sin embargo, a fines de la década de 1990, se habían desarrollado varios enfoques para aislar los complejos similares a agujas (NC) de T3SS. En 1998 se aislaron las primeras NC de Salmonella typhimurium [27] .
Las bacterias aisladas se cultivan en un gran volumen de medio de cultivo líquido hasta que alcanzan la fase logarítmica. Luego se centrifugan; el sobrenadante (medio) se decanta y el sedimento (bacterias) se resuspende en tampón de lisis, que normalmente contiene lisozima y, a veces , detergentes , como LDAO o Triton X-100 . Tal amortiguador destruye la pared celular . Después de varios ciclos de lisis y lavado, las bacterias expuestas se someten a una serie de ultracentrifugaciones . Este enfoque aumenta el número de estructuras macromoleculares grandes y descarta componentes celulares pequeños. Además, el lisado final se somete a una mayor purificación utilizando un gradiente de densidad de CsCl.
Un enfoque adicional para una mayor purificación utiliza la cromatografía de afinidad . Las proteínas T3SS recombinantes que llevan una etiqueta de proteína (p. ej., una etiqueta de histidina ) se obtienen mediante clonación molecular y luego se introducen (transforman) en las bacterias de interés. Después del aislamiento inicial de NC como se describe anteriormente, el lisado se pasa a través de una columna recubierta con partículas de alta afinidad por el marcador (en el caso de marcadores de histidina: iones de níquel). La proteína marcada se almacena en la columna y con ella todo el complejo de agujas. Se pueden lograr altos grados de pureza usando tales métodos. Esta pureza es necesaria para muchos de los análisis delicados que se han utilizado para caracterizar NC.
Los efectores de tipo III se conocen desde principios de la década de 1990, pero la forma en que se administran a las células huésped ha sido un completo misterio. La homología entre muchas proteínas flagelares y las proteínas T3SS llevó a los investigadores a sospechar la existencia de una estructura similar a flagelos externos de T3SS. La identificación y posterior aislamiento de la estructura de la aguja permitió a los investigadores:
Como ocurre con casi todas las proteínas, la visualización de T3SS NC solo es posible con microscopía electrónica . Las primeras imágenes de NC (1998) muestran estructuras de agujas que sobresalen de la pared celular de bacterias vivas y NC planas bidimensionales aisladas [27] . En 2001, las imágenes de NC Shigella flexneri se analizaron digitalmente y se promediaron para producir la primera estructura NC semi-3D [7] . En 2003, se obtuvo una estructura helicoidal de NC de Shigella flexneri con una resolución de 16 angstroms por difracción de fibra de rayos X [28] , y un año después se publicó una estructura tridimensional de 17 angstroms de NC Salmonella typhimurium [29] . Avances y enfoques recientes han hecho posible obtener imágenes 3D de alta resolución de NC [30] [31] , que aclaran aún más la compleja estructura de las NC.
Numerosas proteínas T3SS se han cristalizado en los últimos años. Estos incluyen proteínas estructurales NC, efectores y chaperonas. La primera estructura del monómero complejo de aguja fue la estructura de RMN de BsaL de " Burkholderia pseudomallei " y luego la estructura cristalina de MixH de Shigella flexneri , que se estudiaron en 2006 [32] [33] .
En 2012, una combinación de producción recombinante de complejos de agujas de tipo salvaje, espectroscopia de RMN de estado sólido, microscopía electrónica [34] y modelado de biopolímeros de Rosetta reveló interfaces supramoleculares y, en última instancia, la estructura atómica completa de la aguja T3SS de Salmonella typhimurium [35 ] . Se ha demostrado que las subunidades PrgI de 80 residuos de aminoácidos forman un nudo helicoidal dextrógiro con aproximadamente 11 subunidades por cada dos vueltas de la hélice, similar al flagelo de Salmonella typhimurium . El modelo también reveló un dominio amino terminal extendido que se encuentra en la superficie de la aguja, mientras que el extremo carboxi altamente conservado se dirige hacia la luz [35] .
Se han utilizado varios métodos para identificar la matriz de proteínas que componen el T3SS. Los complejos de agujas aisladas se pueden separar mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE). Las bandas que aparecen después de la tinción se pueden eliminar individualmente del gel y analizar mediante secuenciación de proteínas y espectrometría de masas. Los componentes estructurales de la NC se pueden separar entre sí (por ejemplo, la parte de la aguja de la parte de la base), y analizando estas fracciones se pueden determinar las proteínas involucradas en cada una de ellas. Como alternativa, los complejos de agujas aislados se pueden analizar directamente mediante espectrometría de masas , sin electroforesis previa , para obtener una imagen completa del proteoma NC .
Se ha encontrado que varios compuestos inhiben T3SS en bacterias Gram-negativas, incluida la guadinomina, que es producida naturalmente por especies de Streptomyces [36] .