Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) es un método de biología molecular que permite conseguir un aumento significativo de pequeñas concentraciones de determinados fragmentos de ácido nucleico ( ADN o ARN ) en material biológico (muestra).

Además de la amplificación del ADN , la PCR permite muchas otras manipulaciones con ácidos nucleicos (introducción de mutaciones , empalme de fragmentos de ADN) y se usa ampliamente en la práctica biológica y médica, por ejemplo, para diagnosticar enfermedades (hereditarias, infecciosas), para establecer la paternidad , clonar genes , aislar nuevos genes .

Historia

A principios de la década de 1970, el científico noruego Kjell Kleppe del laboratorio del premio Nobel Hara Gobinda Korana propuso un método para la amplificación del ADN utilizando un par de moléculas cortas de ADN monocatenario: cebadores sintéticos [1] . Sin embargo, en ese momento esta idea no se realizó. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis [2] [3] . Su objetivo era crear un método que permitiera la amplificación del ADN durante múltiples duplicaciones consecutivas de la molécula de ADN original utilizando la enzima ADN polimerasa . La primera publicación sobre el método PCR apareció en noviembre de 1985 en la revista Science [4] . El método ha revolucionado la biología molecular y la medicina. En 1993, Kary Mullis recibió el Premio Nobel de Química por esto [5] .

Al inicio del uso del método, después de cada ciclo de calentamiento-enfriamiento, se debía agregar ADN polimerasa a la mezcla de reacción , ya que se inactivaba a la alta temperatura necesaria para separar las hebras de la hélice de ADN. El procedimiento de reacción fue relativamente ineficiente, requiriendo mucho tiempo y enzima. En 1986, el método de reacción en cadena de la polimerasa mejoró significativamente. Se ha propuesto utilizar ADN polimerasas de bacterias termófilas [6] . Estas enzimas demostraron ser termoestables y pudieron soportar muchos ciclos de reacción. Su uso permitió simplificar y automatizar la PCR. Una de las primeras polimerasas de ADN termoestables se aisló de la bacteria Thermus aquaticus y se denominó polimerasa Taq . La desventaja de esta polimerasa es la probabilidad bastante alta de introducir un nucleótido erróneo, ya que esta enzima carece de mecanismos de corrección de errores (3'→5' - actividad exonucleasa ). Las polimerasas Pfu y Pwo , aisladas de arqueas , tienen tal mecanismo; su uso reduce significativamente el número de mutaciones en el ADN, pero la velocidad de su trabajo (procesividad) es menor que la de Taq . Ahora se utilizan mezclas de Taq y Pfu para lograr una alta velocidad de polimerización y una alta precisión de copia.

En el momento de la invención del método, Kary Mullis trabajaba como químico sintético (sintetizó oligonucleótidos, que luego se usaron para detectar mutaciones puntuales por hibridación con ADN genómico) en Cetus Corporation , que patentó el método PCR. En 1992, Cetus vendió los derechos del método y la patente para el uso de la polimerasa Taq a Hofmann-La Roche por 300 millones de dólares. Sin embargo, resultó que Taq - polimerasa fue caracterizada por los bioquímicos soviéticos A. Kaledin , A. Slyusarenko y S. Gorodetsky en 1980 [7] , y también 4 años antes de esta publicación soviética, es decir, en 1976, por los bioquímicos estadounidenses Alice. Chien, David B. Edgar y John M. Trela [8] . Como resultado, Promega intentó obligar a Roche a renunciar a sus derechos exclusivos sobre esta enzima [9] en los tribunales . La patente estadounidense del método PCR expiró en marzo de 2005.

Realización de PCR

El método se basa en la copia selectiva múltiple de una determinada sección de ácido nucleico de ADN utilizando enzimas en condiciones artificiales ( in vitro ). En este caso, solo se copia el área que cumple las condiciones especificadas, y solo si está presente en la muestra en estudio. A diferencia de la amplificación del ADN en los organismos vivos ( replicación ), la PCR amplifica tramos relativamente cortos de ADN . En un proceso de PCR convencional, la longitud de las regiones de ADN replicadas no supera los 3000 pares de bases (3 kpb [10] ). Con la ayuda de una mezcla de varias polimerasas, con el uso de aditivos y bajo ciertas condiciones, la longitud de un fragmento de PCR puede alcanzar los 20-40 mil pares de bases. Esto sigue siendo mucho menor que la longitud del ADN cromosómico de una célula eucariota. Por ejemplo, la longitud del cromosoma nuclear más corto en humanos (cromosoma 21) es de 46,71 millones de pares de bases [11] .

Componentes de reacción

Para PCR, en el caso más simple, se requieren los siguientes componentes:

Plantilla de ADN que contiene la sección de ADN a amplificar .
Dos cebadores que son complementarios a los extremos opuestos de diferentes hebras del fragmento de ADN deseado.
La ADN polimerasa termoestable es una enzima que cataliza la polimerización del ADN. La polimerasa para uso en PCR debe permanecer activa a alta temperatura durante mucho tiempo, por lo tanto, se utilizan enzimas aisladas de termófilos - Thermus aquaticus ( Taq polimerasa ), Pyrococcus furiosus ( Pfu polimerasa), Pyrococcus woesei ( Pwo polimerasa), Thermus thermophilus ( Tth -polimerasa ) y otros.
Desoxirribo trifosfatos de nucleósidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Iones Mg 2+ necesarios para que funcione la polimerasa.
Solución tampón que proporciona las condiciones de reacción necesarias: pH , fuerza iónica de la solución . Contiene sales, albúmina de suero bovino .

Para evitar la evaporación de la mezcla de reacción, se agrega al tubo de ensayo un aceite de alto punto de ebullición, como vaselina. Si se usa un ciclador de tapa calentada, no es necesario.

La adición de pirofosfatasa puede aumentar el rendimiento de la PCR. Esta enzima cataliza la hidrólisis del pirofosfato , un subproducto de la adición de nucleósidos trifosfatos a la hebra de ADN en crecimiento, a ortofosfato . El pirofosfato puede inhibir la PCR [12] .

Imprimadores

La especificidad de la PCR se basa en la formación de complejos complementarios entre el molde y los cebadores , oligonucleótidos sintéticos cortos de 18 a 30 bases de longitud. Cada uno de los cebadores es complementario a una de las cadenas del molde bicatenario y limita el inicio y el final de la región amplificada.

Después de la hibridación de la plantilla con el cebador (recocido [13] ), este último sirve como cebador para la ADN polimerasa durante la síntesis de la cadena complementaria de la plantilla (ver más abajo ).

La característica más importante de los cebadores es la temperatura de fusión (T m ) del complejo cebador-matriz.

Tm es la temperatura a la que la mitad de las plantillas de ADN forman un complejo con el cebador de oligonucleótidos. La fórmula promedio para calcular T m para un oligonucleótido corto (y para fragmentos largos de ADN), teniendo en cuenta la concentración de iones K + y DMSO :

T_{m}=77,1+11,7\lg[K^{+}]+{\frac {41(G+C)-528}{L))-0,75[\%DMSO]

, [14]

donde es el número de nucleótidos en el cebador, es la concentración molar de iones de potasio, es la suma de todas las guaninas y citosinas . $L$ $K^{+}$ ${\ estilo de visualización G + C}$

Si la longitud y la composición de nucleótidos del cebador o la temperatura de hibridación se eligen incorrectamente, es posible la formación de complejos parcialmente complementarios con otras regiones del ADN molde, lo que puede dar lugar a la aparición de productos inespecíficos. El límite superior de la temperatura de fusión está limitado por la temperatura óptima de acción de la polimerasa, cuya actividad cae a temperaturas superiores a 80 °C.

Al elegir imprimaciones, es deseable cumplir con los siguientes criterios:

composición de GC ~ 40–60%;
cebadores T m cercanos (diferencias no superiores a 5 °C);
la ausencia de estructuras secundarias inespecíficas - horquillas [15] y dímeros [16] ;
La guanina o la citosina son deseables en el extremo 3' , ya que forman tres enlaces de hidrógeno con la molécula molde, lo que hace que la hibridación sea más estable.

Amplificador

La PCR se lleva a cabo en un amplificador , un dispositivo que proporciona enfriamiento y calentamiento periódicos de los tubos de ensayo, generalmente con una precisión de al menos 0,1 ° C. Los termocicladores modernos le permiten establecer programas complejos, incluida la posibilidad de "inicio en caliente", Touchdown PCR (ver más abajo) y el posterior almacenamiento de moléculas amplificadas a 4 °C. Para la PCR en tiempo real, se producen dispositivos equipados con un detector fluorescente . Los instrumentos también están disponibles con una tapa automática y un compartimento para microplacas, lo que les permite integrarse en sistemas automatizados.

El curso de la reacción

Por lo general, cuando se realiza una PCR, se realizan de 20 a 35 ciclos, cada uno de los cuales consta de tres etapas. [≡]

Desnaturalización

La plantilla de ADN de doble cadena se calienta a 94-96 °C (o 98 °C si se usa una polimerasa particularmente termoestable) durante 0,5-2 minutos para que las cadenas de ADN se dispersen. Este paso se denomina fusión ( desnaturalización ), ya que se rompen los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN. Por lo general, antes del primer ciclo, se lleva a cabo un calentamiento prolongado de la mezcla de reacción durante 2 a 5 minutos para la desnaturalización completa de la plantilla y los cebadores.

Recocido

Cuando se separan las hebras, se baja la temperatura para permitir que los cebadores se unan a la plantilla monocatenaria. Esta etapa se llama recocido . La temperatura de recocido depende de la composición de las imprimaciones y normalmente se elige 5 grados por debajo de la temperatura de fusión de las imprimaciones. La elección incorrecta de la temperatura de recocido conduce a una mala unión de los cebadores a la plantilla (a temperatura elevada) oa una unión en el lugar equivocado y la aparición de productos no específicos (a baja temperatura). Tiempo de etapa de recocido - 30 segundos Simultáneamente, durante este tiempo, la polimerasa ya tiene tiempo para sintetizar varios cientos de nucleótidos. Por lo tanto, se recomienda seleccionar primers con un punto de fusión superior a 60°C y realizar el recocido y elongación simultáneamente, a 60–72°C.

Elongación

La ADN polimerasa replica la hebra molde utilizando el cebador como cebador. Esta es la etapa de elongación . La polimerasa inicia la síntesis de la segunda cadena desde el extremo 3' del cebador, que se ha unido a la plantilla, y se mueve a lo largo de la plantilla, sintetizando una nueva cadena en la dirección del extremo 5' al 3'. La temperatura de elongación depende de la polimerasa. Las polimerasas Taq y Pfu comúnmente utilizadas son más activas a 72 °C. El tiempo de elongación depende tanto del tipo de ADN polimerasa como de la longitud del fragmento que se amplifica. Normalmente, el tiempo de elongación se considera de un minuto por cada mil pares de bases. Después del final de todos los ciclos, a menudo se lleva a cabo una etapa adicional de elongación final para completar todos los fragmentos monocatenarios. Esta etapa dura de 7 a 10 minutos.

La cantidad de un producto de reacción específico (limitado por cebadores) aumenta teóricamente en proporción a 2n - 2n, donde n es el número de ciclos de reacción [17] . De hecho, la eficiencia de cada ciclo puede ser inferior al 100 %, por lo que en realidad P ~ (1 + E) n , donde P es la cantidad de producto, E es la eficiencia media del ciclo.

El número de copias de ADN "largas" también crece, pero linealmente, por lo que un fragmento específico domina en los productos de reacción.

El crecimiento del producto requerido está exponencialmente limitado por la cantidad de reactivos, la presencia de inhibidores y la formación de subproductos. En los últimos ciclos de la reacción, el crecimiento se ralentiza, esto se denomina "efecto meseta".

Variantes de PCR

RPA ( amplificación de polimerasa de recombinasa - amplificación de polimerasa de recombinasa ) - se utiliza cuando se necesita amplificación de ADN/ARN en 15 minutos sin un termociclador (reacción isotérmica) [18] [19] .
PCR anidada ( PCR anidada ): se utiliza para reducir la cantidad de productos secundarios de la reacción. Utilice dos pares de cebadores y realice dos reacciones consecutivas. El segundo par de cebadores amplifica la región de ADN dentro del producto de la primera reacción.
PCR invertida (PCR inversa): se utiliza si solo se conoce una pequeña área dentro de la secuencia deseada. Este método es especialmente útil cuando es necesario determinar secuencias vecinas después de que el ADN se haya insertado en el genoma. Para la realización de la PCR invertida se realizan una serie de cortes de ADNcon enzimas de restricciónseguidos de la conexión de fragmentos (ligation). Como resultado, los fragmentos conocidos se encuentran en ambos extremos de la región desconocida, después de lo cual se puede realizar la PCR como de costumbre.
La PCR de transcripción inversa ( RT-PCR ) se usa para amplificar, aislar o identificar una secuencia conocida de una biblioteca de ARN. Antes de la PCR convencional, se sintetiza una molécula de ADN monocatenario en la plantilla de ARNm usando reversatasa y se obtiene un ADNc monocatenario, que se utiliza como plantilla para la PCR. Este método a menudo determina dónde y cuándo se expresan estos genes
PCR asimétrica (PCR asimétrica) - Se realiza cuando es necesario amplificar principalmente una de las cadenas del ADN original. Se utiliza en algunastécnicas de análisishibridaciónysecuenciaciónLa PCR se lleva a cabo como de costumbre, excepto que uno de los cebadores se toma en gran exceso. Una modificación de este método esLinearAfter - The - E xponential - PCR (LATE-PCR)combinacon un (punto de fusión) más alto que el cebador de alta concentración. La PCR se lleva a cabo a una temperatura de hibridación alta, manteniendo así la eficiencia de la reacción a lo largo de todos los ciclos [20] .
La PCR cuantitativa ( PCR cuantitativa, Q-PCR ) o PCR en tiempo real ( reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real ) se utiliza para monitorear directamente la medición de la cantidad de un producto de PCR en particular en cada ciclo de reacción. Este método utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescenciapara analizar la acumulación del producto de reacción o el colorante intercalado SYBR Green (o sus análogos). Sybr Green I proporciona una opción simple y rentable para la detección y cuantificación de productos de PCR en tiempo real sin la necesidad de sondas o cebadores fluorescentes específicos. Durante la amplificación , el colorante SYBR Green I se incorpora en el surco menor del ADN de los productos de PCR y emite una señal fluorescente más fuerte que el colorante libre cuando se irradia con un láser azul. SYBR Green I es compatible con todos los instrumentos de PCR en tiempo real conocidos actualmente. El máximo de absorción para SYBR Green I está en una longitud de onda de 494 nm. Además del principal, existen dos pequeños máximos de absorción adicionales en el espectro del colorante, a 290 nm y 380 nm. La emisión máxima para SYBR Green I es de 521 nm (verde) [21] .
PCR escalonada (PCR de contacto): con este enfoque, se reduce la influencia de la unión no específica de los cebadores. Los primeros ciclos se llevan a cabo a una temperatura por encima de la temperatura óptima de recocido, luego, cada pocos ciclos, la temperatura de recocido se reduce gradualmente a la óptima. Esto es para asegurar que el cebador se hibrida con la hebra complementaria en toda su longitud; mientras que a la temperatura de hibridación óptima, el cebador se hibrida parcialmente con la cadena complementaria. La hibridación parcial del cebador en el ADN genómico conduce a una amplificación no específica si hay suficientes sitios de unión para el cebador. En la mayoría de los casos, los primeros diez ciclos de PCR pueden llevarse a cabo a una temperatura de hibridación de 72-75 °C, y luego reducirse inmediatamente al óptimo, por ejemplo, a 60-65 °C.
Método molecular de colonias (PCR en gel,colonia PCR):gel de acrilamida se polimerizacon todos los componentes de la PCR en la superficie y se realiza la PCR. En los puntos que contienen el ADN analizado, se produce la amplificación con la formación de colonias moleculares.
PCR con amplificación rápida de extremos cDNA (amplificación rápida de extremos cDNA, RACE-PCR).
La PCR de fragmentos largos ( long-range PCR ) es una modificación de la PCR para la amplificación de segmentos de ADN extendidos (10 mil o más bases). Se utiliza una mezcla de dos polimerasas, una de las cuales es una polimerasa Taq con alta procesividad (es decir, capaz de sintetizar una cadena larga de ADN en un solo paso), y la segunda es una ADN polimerasa con actividad 3'-5'-exonucleasa. , generalmente polimerasa Pfu . La segunda polimerasa es necesaria para corregir los errores introducidos por la primera, ya que la polimerasa Taq detiene la síntesis de ADN si se ha añadido un nucleótido no complementario. Este nucleótido no complementario es eliminado por la polimerasa Pfu . La mezcla de polimerasas se toma en una proporción de 50:1 o incluso menos de 100:1, donde las polimerasas Taq se toman 25-100 veces más que las polimerasas Pfu .
RAPD ( Amplificación aleatoria de ADN polimórfico ), PCR con amplificación aleatoria de ADN polimórfico: se usa cuando es necesario distinguir entre organismos que están cerca en secuencia genética, por ejemplo, diferentes variedades de plantas cultivadas, razas de perros o estrechamente microorganismos relacionados. Este método suele utilizar un único cebador pequeño (alrededor de 10 pb). Este cebador será parcialmente complementario a las regiones aleatorias de ADN de los organismos en estudio. Seleccionando las condiciones (longitud del cebador, composición del cebador, temperatura, etc.), es posible lograr una diferencia satisfactoria en el patrón de PCR para dos organismos.
PCR específica de grupo ( group-specific PCR ) - PCR para secuencias relacionadas dentro de la misma especie o entre diferentes especies utilizando cebadores conservadores para estas secuencias. Por ejemplo, la selección de cebadores universales para los genes ribosómicos 18S y 26S para la amplificación de un espaciador intergénico específico de especie: la secuencia de los genes 18S y 26S se conserva entre especies, por lo que la PCR entre estos genes tendrá lugar para todas las especies. bajo estudio Lo opuesto a este método es la PCR única ( unique PCR ), donde la tarea es seleccionar cebadores para amplificar solo una secuencia de todas las relacionadas.
PCR usando hot start (hot start PCR) es una modificación de la PCR usando ADN polimerasa, en la cual la actividad polimerasa es bloqueada a temperatura ambiente por anticuerpos o pequeñas moléculas que simulan anticuerpos como Affibody , es decir, en el momento de configurando la reacción antes de la primera desnaturalización en PCR. Normalmente, la primera desnaturalización se lleva a cabo a 95 °C durante 10 minutos.
La PCR virtual ( in silico PCR , electronic PCR, e-PCR) es un método matemático de análisis informático de una reacción en cadena de la polimerasa teórica que utiliza una lista de secuencias de cebadores (o sondas de ADN ) para predecir la posible amplificación del ADN del genoma , cromosoma , ADNc o cualquier otra región del ADN bajo estudio.

Si la secuencia de nucleótidos de la plantilla se conoce parcialmente o no se conoce en absoluto, se pueden usar cebadores degenerados , cuya secuencia contiene posiciones degeneradas en las que se puede ubicar cualquier base. Por ejemplo, la secuencia del cebador podría ser: ...ATH... donde H es A, T o C.

Aplicación de PCR

La PCR se utiliza en muchas áreas para el análisis y en experimentos científicos.

Criminalística

La PCR se utiliza para comparar las llamadas "huellas dactilares genéticas". Se necesita una muestra de material genético de la escena del crimen: sangre, saliva, semen, cabello, etc. Se compara con el material genético del sospechoso. En teoría, una cantidad muy pequeña de ADN es suficiente: una copia. El ADN se corta en fragmentos y luego se amplifica por PCR. Los fragmentos se separan mediante electroforesis de ADN . La imagen resultante de la ubicación de las bandas de ADN se denomina huella genética .

Establecimiento de la paternidad

Aunque las "huellas dactilares genéticas" son únicas, aún se pueden establecer lazos familiares haciendo varias de esas huellas dactilares. [≡] Se puede aplicar el mismo método, con ligeras modificaciones, para establecer relaciones evolutivas entre organismos.

Diagnósticos médicos

La PCR permite acelerar y facilitar significativamente el diagnóstico de enfermedades hereditarias y virales . El gen deseado se amplifica mediante PCR usando cebadores apropiados y luego se secuencia para determinar las mutaciones . Las infecciones virales se pueden detectar inmediatamente después de la infección, semanas o meses (según la duración del período de incubación ) antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad.

Medicina personalizada

A veces, los medicamentos son tóxicos o alergénicos para algunos pacientes. Las razones de esto se encuentran en parte en las diferencias individuales en la susceptibilidad y el metabolismo de las drogas y sus derivados. Estas diferencias están determinadas a nivel genético. Por ejemplo, en un paciente, un determinado citocromo (una proteína hepática responsable del metabolismo de sustancias extrañas) puede ser más activo, en otro, menos activo. Para determinar qué tipo de citocromo tiene un paciente determinado, se propone realizar un análisis de PCR antes de usar el medicamento. Este análisis se denomina genotipado preliminar (genotipado prospectivo ) .

Clonación de genes

La clonación de genes (que no debe confundirse con la clonación de organismos) es el proceso de aislar genes y, como resultado de manipulaciones de ingeniería genética , obtener una gran cantidad del producto de un gen dado. La PCR se usa para amplificar un gen, que luego se inserta en un vector , una pieza de ADN que transfiere un gen extraño al mismo u otro organismo que es fácil de cultivar. Como vectores se utilizan, por ejemplo, plásmidos o ADN viral. La inserción de genes en un organismo extraño generalmente se usa para obtener un producto de este gen: ARN o, con mayor frecuencia, una proteína. De esta forma, muchas proteínas se obtienen en cantidades industriales para su uso en agricultura, medicina, etc.

Secuenciación de ADN

En el método de secuenciación que utiliza didesoxinucleótidos marcados con un marcador fluorescente o un isótopo radiactivo , la PCR es una parte integral, ya que es durante la polimerización que los derivados de los nucleótidos marcados con un marcador fluorescente o radiactivo se insertan en la cadena de ADN. La adición de un didesoxinucleótido a la cadena sintetizada termina la síntesis, lo que permite determinar la posición de nucleótidos específicos después de la separación en el gel.

Mutagénesis

Actualmente, la PCR se ha convertido en el principal método para realizar mutagénesis (introducir cambios en la secuencia de nucleótidos del ADN). El uso de la PCR permitió simplificar y acelerar el procedimiento de mutagénesis, así como hacerlo más fiable y reproducible.

Sexado molecular

Otra área de aplicación práctica de la PCR es el sexado molecular : determinación del sexo basada en las diferencias sexuales a nivel de ADN entre machos y hembras [22] .

Véase también

Notas

↑ Kleppe, K. et al. (1971): Estudios sobre polinucleótidos. XCVI. Reparar replicaciones de ADN sintético corto catalizado por ADN polimerasas. En: J. Mol. Biol. bd. 56, págs. 341-361. PMID 4927950
↑ Bartlett, JMS; Stirling, D. Una breve historia de la reacción en cadena de la polimerasa // Protocolos de PCR (indefinido) . — 2do. - 2003. - T. 226. - S. 3-6. — (Métodos en Biología Molecular). — ISBN 1-59259-384-4 . -doi : 10.1385/1-59259-384-4: 3 .
↑ Mullis, Kary B. et al. "Proceso para amplificar, detectar y/o clonar secuencias de ácidos nucleicos" Patente de EE. UU. 4 683 195
↑ Saiki RK, Scharf S., Faloona F., Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science 20 de diciembre de 1985; 230 (4732): 1350-4; Amplificación enzimática de secuencias genómicas de beta-globina y análisis de sitios de restricción para el diagnóstico de anemia de células falciformes.
↑ [ Premios Nobel de Química 1993 ] . Consultado el 29 de agosto de 2007. Archivado desde el original el 26 de octubre de 2012. (indefinido) Premios Nobel de Química, 1993 (inglés) ]
↑ RK Saiki, DH Gelfand, S. Stoffel, SJ Scharf, R. Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich. Amplificación enzimática de ADN dirigida por cebador con una polimerasa de ADN termoestable Archivado el 19 de diciembre de 2008 en Wayback Machine . en: Ciencias . 239, 1988, 487-491. ISSN 0036-8075 PMID 2448875
↑ Kaledin A. S., Slyusarenko A. G., Gorodetsky S. I. // Bioquímica. - 1980. - T. 45. - C. 644-651.
↑ Alice Chien, David B. Edgar y John M. Trela. Polimerasa de ácido desoxirribonucleico de Thermus aquaticus termofílico extremo. Journal of Bacteriology, sept. 1976, págs. 1550-1557.
↑ Roche anuncia un acuerdo de conciliación con Promega (enlace descendente) . Consultado el 29 de agosto de 2007. Archivado desde el original el 6 de octubre de 2008. (indefinido)
↑ 1 kbp ( par de bases kilo en inglés ) - 1 mil pares de bases, una unidad de medida de la longitud del ADN
↑ Venter J, et al. (2001). La secuencia del genoma humano. Ciencia 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995
↑ {título} (enlace descendente) . Consultado el 1 de septiembre de 2007. Archivado desde el original el 29 de septiembre de 2007. (indefinido)
↑ Recocido ( recocido ) - hibridación de fragmentos de ADN
↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Temperaturas de fusión de oligonucleótidos en condiciones de pcr: correcciones del vecino más cercano para concentraciones de Mg 2+ , trifosfato de desoxinucleótido y sulfóxido de dimetilo en comparación con fórmulas empíricas alternativas // Clinical Chemistry: revista. - 2001. - vol. 47 , núm. 11 _ - Pág. 1956-1961 . Archivado desde el original el 1 de septiembre de 2012.
↑ Horquilla - estructura autocomplementaria intramolecular
↑ Dímero : estructuras intermoleculares formadas por cebadores entre sí o consigo mismos
↑ Calendar R. N., Sivolap Yu. M. Reacción en cadena de la polimerasa con cebadores arbitrarios // Biopolímeros y células: revista. - 1995. - T. 11 , N° 3-4 . - S. 55-65 . — ISSN 0233-7657 . (Ruso)
↑ Recombinase Polymerase Amplification (RPA): la amplificación isotérmica de ADN/ARN que realmente funciona. . Consultado el 9 de septiembre de 2017. Archivado desde el original el 9 de septiembre de 2017. (indefinido)
↑ Vídeo en inglés: ¿Qué es la amplificación de recombinasa polimerasa? — TwistDx Archivado el 24 de noviembre de 2016 en Wayback Machine .
↑ Pierce KE y Wangh LJ Reacción en cadena de la polimerasa lineal después de la exponencial y tecnologías afines Estrategias de detección en tiempo real para un diagnóstico rápido y confiable a partir de células individuales // Métodos Mol Med. : diario. - 2007. - vol. Métodos en Medicina Molecular™ . - P. 65-85 . — ISBN 978-1-58829-578-1 . -doi : 10.1007 / 978-1-59745-298-4_7 . —PMID 17876077 .
↑ Fluorescencia SpectraViewer Fluorescencia SpectraViewer | Tecnologías de la vida . Fecha de acceso: 30 de octubre de 2012. Archivado desde el original el 15 de noviembre de 2012. (indefinido)
↑ Romanov MN, Ellegren H., Dodgson JB (2001-01-13). Marcadores amplificados por reacción en cadena de la polimerasa para el sexado de aves . IX Conferencia Internacional sobre Genoma Animal y Vegetal (San Diego, 13–17 de enero de 2001) . San Diego, CA, EE. UU.: Scherago International. pags. 118.OCLC 899128222 ._ _ Resumen P229. Archivado desde el original el 20 de septiembre de 2020 . Consultado el 26 de octubre de 2020 . Parámetro obsoleto utilizado |deadlink=( ayuda ) (Inglés)

Literatura

Glick B., Pasternak J. Biotecnología molecular. Principios y aplicación. Por. De inglés. - M .: Mir, 2002. - 589 p., il. — ISBN 5-03-003328-9
Patrushev L. I. Sistemas genéticos artificiales. - M.: Nauka, 2005. - En 2 tomos - ISBN 5-02-033278-X
Shchelkunov S. N. Ingeniería genética. - Novosibirsk: sib. universidad editorial, 2004. - 496 p.; enfermo. — ISBN 5-94087-098-8
Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. Temperaturas de fusión de oligonucleótidos en condiciones de PCR: correcciones del vecino más cercano para concentraciones de Mg 2+ , trifosfato de desoxinucleótido y sulfóxido de dimetilo con comparación con fórmulas empíricas alternativas Archivado el 2 de septiembre de 2011 en Wayback Machine . Clin Chem , 47:1956-1961.
Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. Herramientas web de Java para PCR, PCR in silico y ensamblaje y análisis de oligonucleótidos . Genomics, 98(2): 137-144. http://primerdigital.com/tools/ Archivado desde el original el 16 de septiembre de 2012.

Enlaces

Actividades del laboratorio de PCR. Organización del trabajo durante los estudios PCR de material infectado con microorganismos de los grupos de patogenicidad I-II Copia de archivo fechada el 29 de septiembre de 2010 en la Wayback Machine .
Sitio "Biología clásica y molecular": técnicas relacionadas con PCR Archivado el 8 de junio de 2007 en Wayback Machine .

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