Triplex DNA , H-DNA o triplex-DNA es una forma de ADN en la que tres oligonucleótidos se envuelven entre sí para formar una triple hélice. En el ADN de triple cadena, la tercera cadena de ADN se une a la forma de ADN de doble cadena B formada por interacciones de Watson-Crick , interacciones de Hoogsteen o enlaces de hidrógeno de Hoogsteen inversos . El ADN de tres cadenas puede interferir con la replicación normal y aumentar la frecuencia de mutaciones en la región de formación.
Los oligonucleótidos formadores de triplex (TFO) son oligonucleótidos de 15 a 25 nucleótidos de largo que se unen al surco principal del ADN de doble cadena para formar ADN triplex intermolecular. Los TFO pueden suprimir la transcripción al unirse a la doble hélice del ADN, ya que en este caso los sitios de unión para los factores de transcripción son inaccesibles. La introducción de TFO en una célula se puede usar para controlar la expresión génica, la mutagénesis dirigida al sitio y, en el futuro, puede convertirse en una de las estrategias de terapia génica .
Thymine (T) puede interactuar con el par Watson - Crick T - A a través de un enlace de hidrógeno Hoogsteen. La timina forma enlaces de hidrógeno con la adenina en el par T—A original para formar un triplete T—A*T [1] . En un ambiente ácido, la citosina protonada (C+) también puede interactuar con el par C – G a través de interacciones de Hoogsteen, formando el triplete C–G*C+. Los trillizos T-A*T y C-G*C+ son los trillizos más estables posibles, mientras que los trillizos T-A*G y C-G*G son los menos estables [2] .
Hay dos clases de ADN de triple cadena: intramolecular e intermolecular. En el caso del ADN tríplex intermolecular, se forma un enlace entre el dúplex de ADN y otra hebra de ADN externa, que puede ser de un cromosoma homólogo o ser un oligonucleótido formador de tríplex (TFO ) . El ADN intramolecular de tres cadenas se forma a partir de un dúplex con regiones de homopurina y homopirimidina con simetría especular repetida [3] . La cantidad de ADN de tres cadenas intramolecular formado se ve afectada por el grado de superenrollamiento del ADN [4] . Hay dos tipos de ADN triplex intramolecular: H-DNA y H*-DNA. El H-DNA se forma en un ambiente ácido en presencia de cationes divalentes como Mg 2+ . En esta conformación , la cadena de homopirimidina en el dúplex retrocede para unirse en paralelo a la cadena de purina. Esta conformación está estabilizada por las tríadas de base T—A*T y C—G*A+. En el caso de la última tríada, la citosina debe estar protonada, por lo que es necesario un ambiente ácido para la formación de H-DNA [5] . El H*-DNA se forma a valores de pH neutros en presencia de cationes divalentes. En el caso de H*-DNA, las cadenas de homopirimidina y purina se unen entre sí de forma antiparalela. H*-DNA está estabilizado por las tríadas T—A*A y C—G*G [3] [5] .
Los oligonucleótidos formadores de triplex (TFO) son oligonucleótidos de 15 a 25 nucleótidos de largo que se unen al surco principal del ADN de doble cadena para formar ADN triplex intermolecular. Se han obtenido numerosas evidencias de que in vivo estos oligonucleótidos pueden participar en la regulación de la expresión génica [6] .
Los TFO tienden a unirse a sitios de homopurina u homopirimidina, que se encuentran con mayor frecuencia en la región de promotores e intrones en los genes [7] . Los TFO pueden suprimir la transcripción al unirse a la doble hélice del ADN, ya que en este caso los sitios de unión para los factores de transcripción son inaccesibles. La introducción de TFO en una célula mediante transfección u otros métodos se puede utilizar para controlar la expresión génica [8] , la mutagénesis dirigida al sitio y, en el futuro, puede convertirse en una de las estrategias de terapia génica . Por ejemplo, en 2004 se creó TFO, que se une específicamente al promotor del gen que codifica el factor de transcripción ETS2 , cuya sobreexpresión se observa a menudo en el cáncer de próstata [9] . Se ha desarrollado TFO que interactúa específicamente con el promotor del gen bcl-2 , que codifica una proteína represora de la apoptosis [10] .
La supresión de la transcripción como resultado de la formación de ADN de tres cadenas puede ser la base de enfermedades y condiciones patológicas humanas . Así, en la ataxia de Friedreich , la formación de H-DNA bloquea la expresión del intrón 1 del gen FXN [11] . En última instancia, esto conduce a la puesta en marcha de procesos neurodegenerativos en el sistema nervioso y trastornos del movimiento en las extremidades [12] . La formación de ADN triple puede ser reconocida por el sistema de reparación por escisión de nucleótidos , que repara la estructura de ADN de doble cadena [13] .
Los ácidos peptidonucleicos sintéticos (PNA) también pueden interactuar con el ADN dúplex , en el que el esqueleto de azúcar-fosfato se reemplaza por un esqueleto de pseudopéptido . Cuando el ácido peptidonucleico se une al ADN dúplex, una de las cadenas de ADN se desplaza y se forma un bucle P. Los ácidos peptidonucléicos son resistentes a las proteasas y se pueden utilizar para desencadenar la reparación en el locus objetivo debido a la formación de H-DNA. Los PNA pueden unirse a la cadena complementaria de ADN con alta afinidad y especificidad a través de interacciones Watson-Crick. Durante la formación del ADN tríplex, el PNA interactúa con el dúplex a través de interacciones de Hoogsteen [14] . A diferencia del verdadero ADN triplex, el híbrido de PNA y ADN de doble cadena es estable, ya que el PNA no contiene un esqueleto de azúcar-fosfato con carga negativa, sino un esqueleto de pseudopéptido neutro [15] . A diferencia de los TFO, que se unen al ADN dúplex en la región del surco principal, los PNA interactúan con la doble hélice del ADN de diferentes maneras [14] .
Una secuencia de ADN dúplex de composición mixta puede reconocerse por un par de PNA pseudocomplementarios que pueden invadir dos veces la hélice de ADN debido a la formación simultánea de diaminopurina (D) y tiouracilo ( U S ), que reemplazar adenina y timina, respectivamente [16] . Los PNA pseudocomplementarios forman hélices de la composición PNA:DNA con cada una de las cadenas dúplex debido a la formación de pares D–T, U S –A, G–C y C–G. Otra forma de invasión dúplex puede llevarse a cabo por homopurina PNA debido a la interacción complementaria con la hebra de ADN antiparalela [17] [15] .
Finalmente, los PNA pueden formar una "abrazadera" en el sitio de destino como resultado de la modificación química. Un tipo de "abrazadera" incluye una estructura de dos PNA conectados por un conector flexible: ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico [18] . Esta estructura forma un tríplex PNA:DNA:PNA en el sitio de destino, interactuando uno de los PNA con la hebra de ADN antiparalela utilizando pares de Watson-Crick, mientras que la otra hebra forma pares de Hoogsteen con la otra hebra, la segunda hebra debe contener necesariamente un sitio de homopurina u homopirimidina con el que interactúa el PNA [17] . Otra forma de 'abrazadera' se conoce como ' abrazadera de cola ' . Consiste en una abrazadera PNA:DNA:PNA y un dúplex adicional de ADN:PNA que forma una cola de 5 a 10 pb . En este caso, no hay necesidad de un sitio de homopurina u homopirimidina en el dúplex de ADN original [15] .
La formación de una estructura tan inestable como H-DNA puede causar inestabilidad genómica en el sitio de su aparición [19] . Por ejemplo, junto al promotor P1 del gen c-MYC , existen regiones de polipurina capaces de formar ADN triplex, y su formación conduce a un aumento de la inestabilidad cerca de c-MYC . Los experimentos en ratones transgénicos mostraron que la introducción de secuencias humanas propensas a la transición al estado triplex, junto con secuencias que pueden pasar a Z-DNA , en regiones del genoma para las que no se conocen casos de inestabilidad genética, conduce a la aparición de inestabilidad en ellos [20] . Además, se sabe que la formación de H-DNA puede promover translocaciones entre los cromosomas 14 y 18 , que son la base de muchos cánceres , como el linfoma folicular . Los científicos han demostrado que la reducción de la probabilidad de formación de H-DNA también reduce la probabilidad de translocaciones [20] [21] .
El ADN de tres cadenas puede interferir con la replicación normal y, al igual que otras estructuras de ADN no canónicas, aumenta la frecuencia de mutaciones en la región de formación [22] . Como se señaló anteriormente, H-DNA puede presentar una barrera física para la transcripción. Como demostraron los experimentos con la polimerasa de ARN T7 , el aparato transcripcional no pudo superar las interacciones de Watson-Crick y Hoogsteen que unen las cadenas tríplex, lo que condujo a la interrupción de la transcripción [23] . La detención transcripcional tras la colisión de la maquinaria transcripcional con H-DNA activa la reparación acoplada a la transcripción, por lo que se escinde el H-DNA, lo que da lugar a deleciones [24] .
El ADN de tres cadenas puede ser reconocido por varias nucleasas . Por ejemplo, las nucleasas ERCC1-XPF y ERCC1-XPG, implicadas en la reparación por escisión de nucleótidos, cortan H-DNA en la región del bucle formado por hebras que interactúan mediante pares de Hoogsteen y el extremo 5' de la hebra que forma Watson -Parejas de críquet [25] . Esta brecha puede conducir a grandes deleciones que conducen a la inestabilidad genómica . La nucleasa FEN1 , por el contrario, previene la inestabilidad genómica. Al igual que ERCC1-XPG, introduce una ruptura en el H-DNA en el extremo 5' de la cadena, que no está involucrada en las interacciones de Hoogsteen. En células HeLa que carecen de FEN1 , el número de deleciones cerca de H-DNA es mayor que en células con FEN1, y el efecto mutagénico de H-DNA en células que carecen de FEN1 fue más pronunciado durante la replicación del ADN. Por lo tanto, FEN1 inhibe la mutagénesis inducida por H-DNA de una manera dependiente de la replicación [22] [25] .
Como se mencionó anteriormente, TFO podría ser una herramienta de terapia génica. La principal dificultad en la aplicación médica de TFO y ácidos peptidonucleicos es su entrega a las células [26] . En 2013, como parte de un estudio destinado a cambiar la expresión génica en células hematopoyéticas , se propuso entrecruzar moléculas de ácido peptidonucleico con péptidos de penetración celular (CPP , así como nanopartículas de poli ( ácido láctico-ko-glicico) [27] . Utilizando este enfoque, los autores del trabajo lograron modificar 6 pares de bases en el gen CCR5 , cuyas mutaciones están asociadas con la resistencia al VIH [28] . Los CCP permiten que pequeñas "cargas", como pequeñas biomoléculas , se entreguen libremente dentro de las células . El ácido poli(láctico-co-glicoico) es un polímero biodegradable que puede encapsular moléculas de ácido peptidonucleico en partículas. El suministro de ácidos peptidonucleicos en la composición de nanopartículas a células diana se utilizó en otro estudio sobre el tratamiento de la fibrosis quística . Los ácidos peptidonucleicos, junto con una molécula donante de ADN , se empaquetaron en nanopartículas y se administraron a las células epiteliales bronquiales para editar la mutación en el gen CFTR [29] .
En la década de 1950, cuando se desconocía la estructura exacta del ADN, la hélice de tres cadenas se consideró como uno de los posibles modelos para la organización del ADN en la célula. La estructura de tres cadenas del ADN fue considerada como la más probable por Linus Pauling y Robert Corey [ quienes presentaron el modelo de ADN de tres cadenas en 1953 [ 30] [31] . Watson y Crick, quienes más tarde recibieron el Premio Nobel de Química por determinar la estructura del ADN, también se inclinaron inicialmente por el modelo de tres cadenas, pero vieron en él una serie de problemas que no eran consistentes con los datos experimentales disponibles en ese momento. . En particular, los fosfatos cargados negativamente frente al eje de la hélice se repelerían entre sí por razones electrostáticas , haciendo imposible que exista una triple hélice estable. En el modelo de tres hilos de Pauling y Korey, algunas distancias de van der Waals eran demasiado pequeñas. R. Fraser también propuso su modelo de triple hélice, en el que los fosfatos se ubicaban en la superficie de la hélice y las bases nitrogenadas se giraban hacia adentro, pero no estaba respaldado por datos experimentales [32] .
En 1957 [33] se propuso una estructura alternativa de ADN de tres cadenas . J. Fensenfeld, D. R. Davis y A. Rich predijeron que se podría formar ADN estable de tres cadenas si una cadena constaba solo de nucleótidos de purina y las otras dos consistían solo de pirimidinas [6] [33] . Se creía que in vivo tal estructura se formaba solo como un producto intermedio de la acción de la proteína RecA en el curso de la recombinación en la bacteria Escherichia coli . Los modelos de ADN de tres cadenas propuestos en la década de 1960 predijeron la formación no de pares de Watson-Crick, sino de Hoogsteen en el surco principal del ADN [6] . Algún tiempo después, se propuso un modelo de ADN de tres cadenas, que constaba de una cadena de pirimidina y dos de purina [6] . El descubrimiento de ADN de triple cadena en células vivas a fines de la década de 1980 como parte de plásmidos superenrollados mostró que la formación de H-ADN es, en principio, posible en células vivas [34] . Además, pronto se demostró que la homopirimidina y algunos oligonucleótidos ricos en purina pueden unirse a secuencias específicas en el ADN dúplex, lo que conduce a la formación de ADN de triple cadena [35] .