V(D)J-recombination [1] , o V(D)J-rearrangement [2] ( ing. V(D)J-recombination, V(D)J rearrangement ), es un mecanismo de recombinación de ADN somático que ocurre en etapas tempranas de diferenciación de linfocitos y que conducen a la formación de secciones de anticuerpos que reconocen antígenos y el receptor de células T. Los genes de inmunoglobulinas ( inglés Ig ) y receptores de células T ( inglés TCR ) consisten en segmentos repetidos que pertenecen a tres clases: V (del inglés variable ), D (del inglés diversity ) y J (del inglés .joining ) . Durante el reordenamiento V(D)J, los segmentos de genes, uno de cada clase, se unen. La secuencia combinada de segmentos V(D)J codifica los dominios variables de cada una de las cadenas de receptor o anticuerpo [2] .
Una molécula de anticuerpo (inmunoglobulina) es un tetrámero de dos cadenas pesadas idénticas (cadenas H) y dos cadenas ligeras idénticas (cadenas L). Cada cadena tiene una región variable N-terminal (variable o dominio V) y una región constante (constante o dominio C) en el extremo C-terminal . El dominio variable está involucrado en el reconocimiento de antígenos y el dominio C es responsable de las funciones efectoras. Como sugiere el nombre, la secuencia de aminoácidos del dominio V es variable, mientras que el dominio C muestra un pronunciado conservadurismo . La máxima variabilidad se manifiesta precisamente en la región responsable de la unión al antígeno [3] . El sitio de unión al antígeno está formado por dominios V de cadenas pesadas y ligeras (dominios VH y VL , respectivamente) [4] . La cadena L contiene un dominio C (denominado C L ), y la cadena H contiene 3 o 4 dominios, que se denotan C H 1, C H 2, C H 3, C H 4. Los dominios C no están involucrados en el reconocimiento de antígenos. y son necesarios para la interacción con los receptores de las células inmunitarias , la activación del sistema del complemento y otras funciones efectoras [5] .
A diferencia de la mayoría de los genes, los genes del receptor de inmunoglobulina y de células T no están presentes en su totalidad en la línea germinal y las células somáticas . La formación de un único gen que codifica los dominios V y C se produce mediante uno (en el caso de las cadenas ligeras) o dos (en el caso de las cadenas pesadas) actos de recombinación somática. Los dominios V y los dominios C están codificados por segmentos separados del gen V y el gen C, respectivamente, y no se pueden expresar solos: en este sistema, dos "genes" codifican un solo polipéptido , uno ligero o uno pesado. cadena. Cualquiera de una pluralidad de segmentos del gen V puede conectarse a cualquiera de varios segmentos del gen C. Las cadenas ligeras se forman como resultado de un solo acto de recombinación. Hay dos tipos de cadenas ligeras: κ y λ. La cadena ligera λ se forma por recombinación entre el gen V λ y el segmento J λ C λ . La letra J se abrevia como el sitio con el que se conecta el segmento V λ , es decir, la reacción de conexión no ocurre directamente entre los segmentos V λ y C λ , sino a través del segmento J λ . Este segmento codifica varios residuos de aminoácidos (a.o.) de la región variable y en el gen formado por recombinación, el segmento V λ -J λ es un único exón que codifica la región variable completa. En el caso de una cadena ligera tipo κ, la cadena también se ensambla a partir de dos segmentos, sin embargo, después del gen V κ , sigue un grupo de cinco segmentos J κ , que está separado del exón C κ por un intrón 2 para 3 mil pares de bases de largo . Durante la recombinación, el segmento V κ puede unirse con cualquiera de los segmentos J κ , y el exón variable intacto consiste en última instancia en los segmentos V κ y J κ . Los segmentos J κ ubicados a la izquierda del segmento J κ recombinante se eliminan, y los segmentos J κ a la derecha del segmento recombinante se vuelven parte del intrón entre los exones variables y constantes [6] .
Las cadenas pesadas se forman como resultado no de uno, sino de dos actos de recombinación, y elementos tales como el gen VH, el segmento D y el segmento del gen VH CH están involucrados en su formación. El segmento D es una sección de 2-13 a. o., separando las secuencias que codifican el segmento VH y el segmento JH . El sitio de los segmentos D en el cromosoma también se encuentra entre los conjuntos de segmentos VH y segmentos JH . La combinación de VH -DJH ocurre en dos etapas: primero, uno de los segmentos D se conecta a los segmentos JH , y luego el segmento VH se recombina con el segmento DJ H combinado . La secuencia resultante de tres elementos VH -DJH se coexpresa con el gen CH , que se ubica a la derecha de VH -DJH e incluye cuatro exones . En los seres humanos, el locus del segmento D contiene 30 segmentos D en tándem , seguidos de un grupo de 6 segmentos JH . Aún se desconoce cómo se asegura que el mismo segmento D participe en los eventos de recombinación DJH y VH -DJH . Por el nombre de los elementos individuales, el proceso de ensamblaje de un solo locus que codifica una cadena ligera o pesada se denominó recombinación V(D)J [7] .
El receptor de células T ( TCR ) es un heterodímero de dos subunidades : α y β (receptor TCRαβ) o γ y δ (receptor TCRγδ), que codifican los genes TCRA, TCRB, TCRG y TCRD, respectivamente. Aunque las secuencias que codifican la cadena δ del TCR están ubicadas dentro del gen de la cadena α, por lo general se consideran un grupo genético distinto . Como en el caso de las inmunoglobulinas, el receptor de células T incluye dominios constantes y genes C que los codifican, dominios V que codifican genes V y segmentos J que separan grupos de genes C y genes V (en el TCRB y Los genes TCRD también están presentes en los segmentos D). Durante la formación de cada una de las cuatro cadenas TCR posibles, también se produce la recombinación V(D)J [8] . En el caso de los genes TCRB y TRCD que contienen segmentos D, la recombinación ocurre en dos etapas (primero entre los segmentos D y J, luego entre los segmentos DJ y V), y en el caso de TCRA y TRCG, en una sola etapa [9] .
Por lo tanto, solo siete loci de genes están sujetos al reordenamiento V(D)J: la cadena pesada de inmunoglobulina (IgH), las cadenas ligeras κ y λ, así como cuatro genes de receptores de células T que codifican las cadenas α, β, γ, δ: TCRA, TCRB, TCRG y TCRD respectivamente. Los segmentos D están presentes sólo en el gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina, TCRB y TCRD [10] .
Los genes V de todas las cadenas polipeptídicas implicadas en el reconocimiento de antígenos se reordenan, pero no al mismo tiempo, sino secuencialmente. En las células B , los genes de la cadena pesada se reorganizan primero y luego los genes de la cadena ligera (las cadenas ligeras de tipo K se reorganizan primero, luego las cadenas ligeras de tipo λ). En las células T , durante la formación de los genes TCRαβ, los genes de la cadena β y luego los genes de la cadena α se reorganizan primero. En el caso de TCRγδ, el reordenamiento de los genes de los dominios variables de las cadenas γ y δ ocurre casi simultáneamente [11] .
La recombinación V(D)J continúa hasta completarse solo en las células T y B bajo la influencia de las señales de diferenciación del entorno externo. Las etapas iniciales de reordenamiento en forma de recombinación DJ también pueden ocurrir en células que no están relacionadas con las células T y B, por ejemplo, los asesinos naturales , que tienen un origen cercano a las células T [12] . El mecanismo molecular de la recombinación V(D)J de los siete loci de inmunoglobulinas o receptores de células T es idéntico [13] . La secuencia de las reacciones de recombinación V(D)J se describe en la sección anterior, y los mecanismos moleculares de la recombinación V(D)J también se describirán aquí.
La recombinación ocurre en las secuencias señal de ADN inmediatamente adyacentes a los segmentos de genes. Estas secuencias conservadas se denominan secuencias de señal de recombinación ( secuencia de señal de recombinación en inglés , RSS) y constan de siete nucleótidos - 5'-CACAGTG-3' ( heptámero ), seguido de una secuencia de 12 o 23 nucleótidos - un espaciador , y más un bloque conservador de nueve nucleótidos - 5'-ACAAAAACC-3' (nonamer). La secuencia del espaciador puede variar, pero la longitud es conservadora y corresponde a una (12 nucleótidos) o dos (23 nucleótidos) vueltas de la doble hélice del ADN El reordenamiento ocurre solo entre dos RSS, uno de los cuales tiene un espaciador de 12 pares de bases (pb), el otro tiene un espaciador de 23 pb, la llamada "regla de recombinación 12/23". Este patrón de estructura RSS determina la secuencia de recombinación correcta: por ejemplo, el locus IGH tiene un RSS de 23 pb. en el extremo 3' de cada segmento V, RSS de 12 pb de longitud. en los extremos 3' y 5' de cada segmento D y un RSS de 23 pb. en el extremo 5' de cada segmento J. Por lo tanto, el reordenamiento VJ de este locus no es posible. La disposición de las secuencias de consenso en los segmentos V o J puede ser cualquiera, es decir, diferentes espaciadores sirven solo para evitar la recombinación del segmento V o J con el mismo segmento y no llevan información significativa [14] .
Las proteínas RAG1 y RAG2 ( genes de activación de recombinación ) son necesarias y suficientes para introducir roturas de ADN durante la recombinación V(D)J . Los ratones que carecen de los genes RAG1 y RAG2 solo tienen células T y B inmaduras porque no pueden formar anticuerpos funcionales ni receptores de células T. RAG1 reconoce secuencias señal con espaciadores correspondientes de 12 o 23 pb. y recluta RAG2 al complejo de reacción. Secuencia de señales de 9 p. es el sitio de reconocimiento primario, y la secuencia de 7 pb. indica la ubicación del corte. Como resultado de la dimerización de RAG1 y RAG2, las secuencias asociadas a ellos se acercan entre sí, lo que también se ve facilitado por interacciones complementarias entre secuencias señal, que son posibles debido a su palindromicidad . El heterodímero HMG1/2 también participa en la convergencia de secuencias relacionadas con RAG1 y RAG2. El complejo RAG1/2 introduce una rotura de una sola hebra en cada una de las dos regiones que se unirán por recombinación. En los extremos de cada una de las dos roturas de cadena sencilla, hay un grupo fosfato en el extremo 5' y un grupo hidroxilo en el extremo 3' (3'-OH). El 3'-OH adyacente al segmento codificante ataca el enlace fosfodiéster en la posición adecuada del otro lado del dúplex de ADN. Como resultado de esta reacción, se forma una horquilla en el sitio de cada rotura de una sola hebra , en la que el extremo 3' de una de las dos hebras de la hélice de ADN está unido covalentemente al extremo 5' de la segunda hebra del dúplex. Las horquillas en los extremos de los segmentos de codificación son reconocidas por un heterodímero de las proteínas Ku70 y Ku80 , y la proteína Artemis abre las horquillas. Además, los extremos de los segmentos codificantes están conectados por el mismo mecanismo que en la conexión no homóloga de los extremos durante la reparación del ADN . Si se produce una ruptura de la cadena de ADN cerca de la horquilla final, se forma una región monocatenaria larga al final del segmento de codificación. A continuación, se completa una cadena complementaria a la misma, y se introducen varios nucleótidos adicionales en la región del final del segmento codificante, que forman una secuencia palindrómica con respecto a la original (por eso se denominan P-nucleótidos del inglés palindrómico ). Los nucleótidos adicionales entre los segmentos de codificación también pueden provenir de otro proceso. La enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) introduce una pequeña cantidad (hasta 20, generalmente menos de 10) de nucleótidos aleatorios adicionales (N-nucleótidos) entre los extremos de los segmentos, después de lo cual se ligan en una vía de unión de extremos no homólogos. [15] . La sección de corte que contiene las secuencias de señales RSS se cierra para formar una estructura en forma de anillo conocida como círculo de escisión de recombinación (REC del inglés. Círculo de escisión de recombinación ) [9] .
La reunión de los extremos de los segmentos codificantes se produce por el mecanismo de unión de extremos no homólogos con la participación de enzimas ADN ligasa IV, proteína quinasa dependiente de ADN , proteínas Ku70/Ku80, XRCC4 y factor de unión de extremos no homólogos 1 [16] . Esto completa el ensamblaje del gen que codifica la cadena de inmunoglobulina o TCR. La proteína quinasa dependiente de ADN está involucrada en la activación de la proteína de resolución de horquilla de Artemis a través de la fosforilación [17] . La combinación de proteínas RAG1, RAG2, proteína quinasa dependiente de ADN, ADN ligasa IV, TdT, HMG1/2 y Ku70/Ku80 se denomina complejo de recombinación V(D)J [18] .
Gracias a la recombinación V(D)J se crea una enorme variedad de anticuerpos en el cuerpo de un vertebrado . Un solo locus de cadena pesada puede dar lugar a más de 10 8 combinaciones diferentes de VH -JH -C H . Los loci de cadenas ligeras pueden dar lugar a alrededor de un millón de cadenas de tipo λ o κ recombinadas [19] . El espectro completo de anticuerpos en la sangre en 2008, George Church propuso llamar al término V(D)J-th [20] .
En algunos casos, la recombinación V(D)J puede dar lugar a inversiones o deleciones . Entonces, a veces en loci de cadenas ligeras del tipo λ, el segmento V λ tiene una orientación en el cromosoma que es opuesta a la orientación del locus J λ -C λ , y la ruptura y reunión en este caso conducirá a la inversión del sitio delecionado con secuencias señal en lugar de su escisión del cromosoma (deleción) . Las consecuencias funcionales de la inversión para el sistema inmunitario no difieren de las de la deleción. La recombinación por inversión se produce en los loci TCR, las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de tipo κ [21] .
Cuando el reordenamiento de un gen V particular tiene éxito, la expresión de los genes RAG se detiene y el gen en el cromosoma homólogo permanece sin reordenar y no funciona. Aproximadamente dos tercios de los eventos de recombinación V(D)J fallidos se deben al cambio de marco . Si el reordenamiento falla, la recombinación V(D)J comienza en el cromosoma homólogo , y si se completa con éxito, el gen del cromosoma homólogo sigue siendo el único funcional, es decir, se produce la exclusión alélica . En el 45% de los casos, la recombinación V(D)J falla en ambos cromosomas del linfocito y muere por apoptosis . En el caso de αβ-TCR, cuando falla el reordenamiento del gen de la cadena α, el proceso de edición se reinicia y el gen RAG se vuelve a expresar. La recombinación continúa con la participación del segmento Vα, que no se extirpó del cromosoma y no entró en el anillo de escisión. El proceso puede repetirse hasta que se genere un gen funcional que codifique la cadena ligera. Durante el embarazo o cuando una célula T reconoce un autoantígeno , puede ocurrir la edición del gen de la cadena α . Si se edita el gen de la cadena α, que está en la configuración de la línea germinal en el segundo cromosoma de un par de homólogos, entonces puede surgir una situación que viole la regla de exclusión alélica: en una célula T habrá dos TCR con el mismo Cadenas β, pero cadenas α diferentes [22] .
Las violaciones de la recombinación V(D)J conducen al desarrollo de estados de inmunodeficiencia . En el síndrome de inmunodeficiencia combinada grave , el nivel de recombinación V(D)J en loci que codifican inmunoglobulinas y receptores de células T es muy bajo. El síndrome de inmunodeficiencia combinada grave es causado por mutaciones que producen proteínas de recombinación V(D)J no funcionales: RAG1, RAG2, Artemis o proteína quinasa dependiente de ADN [23] [17] .
Con base en datos sobre la presencia de dominios constantes y variables en la molécula de inmunoglobulina, Dreyer y Bennett sugirieron en 1965 que dos genes, V y C, están involucrados en la construcción de una sola cadena pesada o ligera de inmunoglobulina [24] . En 1976, Suzumi Tonegawa inició una serie de experimentos y demostró que los genes que codifican anticuerpos sufren reordenamientos que crean una gran variedad de anticuerpos [25] . En 1987, Tonegawa recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por descubrir los mecanismos de la diversidad de anticuerpos [26] .
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