Cósmidos (Cosmides) - plásmidos que contienen un fragmento de ADN del fago lambda que incluye la sección cos [1] . Junto con los sistemas de empaquetamiento de partículas de fagos in vitro , se utilizan como moléculas de vector para la clonación de genes y en la construcción de bibliotecas genómicas. Los cósmidos fueron construidos por primera vez por Collins y Brüning en 1978 [2] . Su nombre proviene de la abreviatura de dos términos: cos -sección (el término en sí, a su vez, proviene del extremo cohesivo inglés s - extremos pegajosos) y plásmido .
Los cósmidos pueden usarse para clonar segmentos de ADN de 32-47 kb . Plásmidos, si clonas en ellos secciones de ADN mayores de 4-5 kb. volverse inestable debido a una creciente tendencia a recombinarse . Además, los cósmidos se empaquetan en partículas de fago, lo que les permite administrarse a las bacterias mediante la transducción .
La región cos consta de ~200 pares de bases y se requiere para empaquetar el cósmido en una partícula de fago. Contiene un sitio cosN en el que la enzima terminasa hace una rotura monocatenaria de cada una de las cadenas de ADN a una distancia de 12 pb. de cada uno. El cósmido cíclico se linealiza para formar extremos cohesivos de 12 pb. (El ADN debe ser lineal para entrar en la cabeza del fago). El sitio cosB contiene la terminasa mientras corta el ADN. El sitio cosQ en el siguiente cósmido (debido a que la replicación del anillo rodante a menudo conduce a la formación de concatámeros ) es retenido por la terminasa después de que se empaqueta el cósmido anterior. Esto hace posible proteger los cósmidos lineales de la escisión por las ADNasas.
En esencia, el cósmido es el ADN del fago lambda , del que se han eliminado todos los genes, excepto el sitio cos . El cósmido tiene un tamaño de aproximadamente 5 kb .e incluye necesariamente los siguientes elementos: un sitio cos requerido para el empaquetamiento en viriones del fago lambda , un origen para la replicación en una célula bacteriana o eucariota, sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción y un gen marcador (por ejemplo, un gen para la resistencia a cualquier antibiótico ) [3] .
Los cósmidos pueden usarse para clonar segmentos de ADN de 32-47 kb . Para ello, el cósmido y el ADN extraño se tratan con la misma endonucleasa de restricción, tras lo cual se mezclan los fragmentos lineales resultantes y se lleva a cabo una reacción de ligadura. A continuación, el ADN se empaqueta en cabezas de fago in vitro , se corta en sitios cos . Las proteínas virales necesarias se obtienen del lisado de E. coli cI857 ( rojo - gam - Sam y Dam (cabeza) y Eam (cola)). Este proceso va acompañado de la selección de fragmentos por tamaño, ya que solo se puede empaquetar ADN con una longitud del 78-105% del genoma del fago lambda . Por lo tanto, los cósmidos predominantemente recombinantes que contienen una región de ADN clonada entrarán en los viriones. Los productos de la ligadura entre dos cósmidos serán demasiado pequeños para empaquetarlos, y entre dos fragmentos de ADN extraño serán grandes.
Las partículas de fago resultantes con cósmidos recombinantes se utilizan para infectar células de E. coli. En el citoplasma, los cósmidos se ciclan mediante la unión del extremo pegajoso y la acción de la enzima ligasa , y luego se replican como los plásmidos regulares sin exhibir ninguna de las propiedades de un fago lambda. La selección de células transformadas se realiza según el gen marcador presente en la molécula vector.
Dado que los cósmidos permiten clonar secciones relativamente grandes de ADN, son vectores convenientes para crear bibliotecas de fragmentos del genoma eucariótico obtenidos por digestión parcial con endonucleasas de restricción . Sin embargo, los productos de tal escisión pueden ser de diferentes tamaños, y hay casos en los que se ligan dos fragmentos relativamente pequeños que no eran adyacentes en el genoma y se crea el clon correspondiente, lo que dará una impresión falsa de su posición en los cromosomas . . Este problema se puede superar fraccionando los productos de digestión parcial según el tamaño. Sin embargo, incluso este método no evita por completo la aparición de clones de cósmidos que contienen varios fragmentos de ADN ligados, por lo que se han propuesto otros métodos, en particular, la desfosforilación de fragmentos de ADN extraños para que no puedan combinarse entre sí. También se han creado vectores cósmidos especiales pJB8 (Burke e Ish-Horowicz, 1981) y c2XB (Bates y Swift, 1983), con los que se minimiza la probabilidad de formación de falsos clones.
Los cósmidos modernos de las series pWE y sCos se caracterizan por la presencia de varios sitios de clonación rodeados por fagos promotores y sitios únicos de reconocimiento por las endonucleasas de restricción Not I, Sac II y Sfi I, que permiten que una enzima corte el inserto.
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