Fluorescencia en la investigación biológica

La fluorescencia ha encontrado una amplia aplicación en diversas investigaciones biológicas y biomédicas aplicadas [1] . Este es un fenómeno físico, cuya esencia es la absorción a corto plazo de un cuanto de luz por un fluoróforo (sustancia capaz de emitir fluorescencia) seguida de la emisión rápida de otro cuanto, que tiene propiedades diferentes al original [2] . Muchas áreas de la biofísica , la biología molecular y celular han surgido y se están desarrollando precisamente debido a la introducción de nuevos métodos basados ​​en la fluorescencia. Vale la pena señalar algunos ejemplos.

Para los biofísicos, la fluorescencia se ha convertido en un método rápido y sensible para estudiar la estructura, la dinámica y las funciones de las macromoléculas biológicas  : ácidos nucleicos [3] y proteínas [4] .

El método de secuenciación del ADN , gracias al trabajo de Sanger , mejoró significativamente en la segunda mitad de la década de 1980 precisamente debido a la introducción de la detección por fluorescencia. Una consecuencia importante de esto fue la alta velocidad y confiabilidad de la secuenciación. Además, el método ha sido automatizado [5] [6] . Esto abrió la posibilidad técnica de realizar secuenciaciones a gran escala (a la escala de la época) y permitió el inicio del Proyecto Genoma Humano a principios de la década de 1990 . Aunque la secuenciación de Sanger ha dejado de utilizarse casi por completo, la fluorescencia sigue utilizándose en los métodos de secuenciación de ADN de última generación [7] [8] .

La fluorescencia dio un nuevo impulso al desarrollo de la biología celular. Gracias a la microscopía de fluorescencia confocal y al desarrollo de nuevas etiquetas fluorescentes basadas en la proteína fluorescente verde (GFP) y sus análogos, fue posible obtener tinciones de contraste específicas y fotografías de alta resolución de muchas estructuras de proteínas intracelulares. El desarrollo de nuevas sondas fluorescentes -sustancias que cambian la fluorescencia cuando se les une una determinada molécula- permitió estudiar en detalle la composición química de las células vivas e incluso de los organismos, así como su cambio en el tiempo y el espacio, lo que marcó la comienzo de la formación de imágenes moleculares fluorescentes (imagen molecular en inglés  ) [9] [10]

La base física de la fluorescencia

La fluorescencia es uno de los fenómenos que pueden ocurrir durante la interacción de la radiación electromagnética con la materia.

En condiciones normales, la gran mayoría de las moléculas se encuentran en el estado electrónico fundamental. Las moléculas pueden absorber cuantos de radiación electromagnética de cierta energía y entrar en un estado excitado. Esto corresponde a la transición de un electrón desde el orbital molecular más alto ocupado al más bajo libre . Según su multiplicidad , los estados electrónicos fundamental y excitado se denotan por y . La excitación de la mayoría de los fluoróforos ( ) se produce bajo la acción de la luz ultravioleta de onda corta (longitud de onda 300-400 nm) o luz visible (longitud de onda 400-800 nm). Después de la transición del fluoróforo a un estado excitado, se produce la relajación, un proceso en el que la molécula pierde parte de la energía; al hacerlo, desciende al subnivel vibratorio más bajo del nivel electrónico . En un medio líquido en condiciones normales, este proceso ocurre en un tiempo del orden de varios picosegundos ( 10-12 s). De acuerdo con la regla de Kashi, es desde el subnivel vibratorio más bajo del nivel electrónico que se produce una transición al estado electrónico fundamental, que se acompaña de fluorescencia. Debido a la pérdida de energía durante la relajación y algunas otras razones, la radiación fluorescente tiene menos energía (y, en consecuencia, una longitud de onda más larga ) en comparación con la luz que se absorbe durante la excitación [2] .

La figura anterior no muestra otros procesos que compiten con la fluorescencia. En particular, durante la existencia de una molécula en estado excitado , puede tener lugar una conversión interna , es decir, una transición no radiativa . También existe la posibilidad de la transición de la molécula al estado de triplete debido a la conversión de intercombinación. Una imagen completa de las posibles transiciones se puede ver en el diagrama de Yablonsky . La fluorescencia no debe confundirse con otros tipos de luminiscencia como la fosforescencia , la quimioluminiscencia , la bioluminiscencia , etc. [11]

Detección de fluorescencia

En el caso más simple, la observación de fluorescencia requiere solo una solución de un compuesto fluorescente y una fuente de luz de excitación adecuada. Las lámparas ultravioleta portátiles son una fuente conveniente de excitación.

Los principales instrumentos para estudiar la fluorescencia en el laboratorio son los espectrofluorímetros [12] . En la figura se muestra un diagrama muy simplificado de dicho dispositivo. Los espectrofluorómetros utilizan una variedad de fuentes de luz, más comúnmente lámparas de xenón de alta presión . Dan un amplio espectro de emisión (desde luz ultravioleta hasta luz infrarroja ). La radiación de la lámpara va al monocromador de excitación , que da la luz de salida con una cierta longitud de onda deseada . Después de eso, se dirige un haz monocromático a la muestra, lo que hace que emita fluorescencia. Es importante que la emisión fluorescente sea isotrópica , es decir, que su intensidad sea la misma en todas las direcciones (no depende del ángulo en el que se observe). Esto hace que sea fácil separarlo de la luz emocionante. La ubicación del detector en un ángulo de 90° con respecto a la dirección de excitación permite capturar solo aquellos fotones que son el resultado de la emisión fluorescente. La luz fluorescente pasa a través de otro monocromador (monocromador de emisión ). Después de eso, la intensidad del flujo de luz se mide usando un detector.

Los componentes enumerados aquí (fuente de luz, monocromadores, detector) en varias versiones y combinaciones están presentes en todos los dispositivos que miden la fluorescencia. Dependiendo de la finalidad del dispositivo, la configuración y características de cada uno de los elementos del sistema pueden variar. Por ejemplo, se pueden usar conjuntos de filtros en lugar de monocromadores; los láseres [1] se pueden utilizar como fuentes de luz monocromática .

Características de la emisión fluorescente

Hay una serie de parámetros cuantitativos que describen la emisión fluorescente.

Parámetro Designacion Descripción
Intensidad fluorescente , o Este parámetro es proporcional al número de fotones que llegan al detector durante una unidad de tiempo. Se mide en número de fotones por segundo (cps, cuentas por segundo) o en unidades relativas (AU, unidades arbitrarias). Este parámetro depende tanto de la muestra de prueba como del dispositivo en el que se toman las medidas.
espectro de fluorescencia El espectro de fluorescencia es la dependencia de la intensidad de fluorescencia de la longitud de onda de detección (λem ) , registrada en un valor estable de la longitud de onda de excitación (λex ) . En el caso más simple, la dependencia tiene la forma de una curva asimétrica con un máximo. La posición de la emisión máxima muestra de qué color emite fluorescencia el compuesto. Así, el máximo de fluorescencia a 450 nm corresponde aproximadamente a la luz azul, el máximo a 650 nm significa fluorescencia roja, etc. La amplitud del espectro de fluorescencia de los colorantes orgánicos oscila entre varias decenas y varias centenas de nanómetros. El ancho del espectro de fluorescencia de los puntos cuánticos es más pequeño y asciende a varias decenas de nanómetros.
Vida útil de la fluorescencia Para cada compuesto fluorescente, se puede medir una cantidad que tiene la dimensión del tiempo y se denomina "tiempo de vida de la fluorescencia". Esto es del orden de nanosegundos para la mayoría de los fluoróforos . Muestra el tiempo de vida promedio de una molécula en un estado excitado. Si traza el decaimiento de la fluorescencia a lo largo del tiempo, se verá como una curva exponencial . En el caso más simple, la caída será monoexponencial, es decir, se verá como una línea recta en coordenadas logarítmicas.

Una vida útil de 1 ns no significa que la fluorescencia de la muestra desaparezca por completo en un nanosegundo. Este valor significa el tiempo de vida promedio de un fluoróforo excitado en una gran población. La fluorescencia, como la desintegración radiactiva, es un proceso estocástico . Es decir, cada molécula individual puede emitir un fotón en un tiempo tanto más corto como más largo que [1] .

Rendimiento cuántico de fluorescencia Indica la cantidad de fotones absorbidos que se emiten como fluorescencia. Como se señaló anteriormente, la fluorescencia compite con una serie de otros procesos, como la conversión interna y entre sistemas . Además de ellos, también existe la posibilidad de destrucción del fluoróforo por transformación química (fotoblanqueo). Como resultado, el número de fotones emitidos debido a la fluorescencia siempre es menor que el número de fotones absorbidos (F < 1).

Fenómenos relacionados importantes para aplicaciones biológicas

En estudios de sistemas biológicos, algunos de los fenómenos asociados con la fluorescencia son útiles.

Fenómeno Descripción y características principales
Anisotropía de fluorescencia Muestra cuánto cambia la orientación de las moléculas excitadas durante la existencia del estado excitado [1] [11] . Las mediciones de anisotropía de fluorescencia requieren espectrofluorímetros equipados con polarizadores de excitación y luz fluorescente. Conociendo la intensidad de la luz fluorescente polarizada en planos paralelos y perpendiculares, la anisotropía se puede calcular mediante la fórmula:

La anisotropía de fluorescencia muestra la libertad de rotación de una molécula durante la existencia de un estado excitado. Los fluoróforos libres en disolventes líquidos giran rápidamente en condiciones normales, lo que provoca una despolarización completa (r = 0). Si el fluoróforo está asociado con una biomolécula grande , como un glóbulo de proteína , dicho complejo gira en el espacio más lentamente, lo que da como resultado valores de anisotropía distintos de cero. El máximo teóricamente posible es 0,4 [11] . La anisotropía de fluorescencia se usa ampliamente para estudiar proteínas y las interacciones entre ellas [13] .

Apagado de fluorescencia A veces, la intensidad de la fluorescencia se reduce significativamente en presencia de ciertos compuestos en solución. Este fenómeno se denomina extinción de la fluorescencia , y los compuestos que lo provocan se denominan extintores, extintores ( ing.  extintores )

El ejemplo clásico es el oxígeno, que es un extintor de una gran cantidad de fluoróforos orgánicos [1] . Matemáticamente, la extinción de la fluorescencia se describe mediante la ecuación de Stern-Volmer .

Aquí  , es la relación entre la fluorescencia inicial y la fluorescencia en presencia de un extintor;  es la constante de Stern-Volmer;  es la concentración del extintor.

Un gráfico en coordenadas  se llama gráfico de Stern-Volmer.

El enfriamiento puede ser estático o dinámico. Durante el apagado estático, el fluoróforo en el estado electrónico fundamental forma un complejo no fluorescente con el apagador. Durante el apagado dinámico, se forma un estado excitado común, que es destruido por el apagador incluso antes de que se produzca la emisión fluorescente [1] .

Los experimentos de extinción de la fluorescencia de triptófano con acrilamida se utilizan a menudo para analizar la conformación de las moléculas de proteína [1] . Además, la extinción de fluoróforos orgánicos se utiliza en el desarrollo de sondas fluorescentes [11]

Transferencia de energía resonante de Förster (FRET) La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET ) es un  proceso que involucra dos fluoróforos, un donante de transferencia ( D ) y un aceptor ( A ). Durante FRET, la energía se transfiere de un fluoróforo a otro. Es decir, al excitar una molécula (donante), se puede observar la fluorescencia de la otra (aceptor).

Para FRET, se deben cumplir varias condiciones [1] , a saber:

  • el espectro de fluorescencia del donante debe solaparse con el espectro de absorción del aceptor;
  • El donante y el aceptor deben estar dentro de una cierta distancia el uno del otro.
  • los momentos dipolares del donante y del aceptor deben tener una determinada posición relativa en el espacio.

Es importante que FRET se produzca a distancias acordes con el tamaño de los objetos biológicos, como glóbulos de proteínas o membranas celulares . En este caso, la eficiencia relativa de la transferencia de energía depende inversamente de la distancia entre los socios de FRET. La eficacia del FRPE se calcula mediante la fórmula.

aquí está el radio de Förster: esa distancia entre el donante y el aceptor en la que la eficiencia de transferencia es ½.

Si dos biomoléculas marcadas con un par de FRPE están a una gran distancia, solo se observará su propia fluorescencia tras la excitación del donante. En el caso de que las moléculas estén próximas en el espacio, al excitarse el donante se observará la emisión del aceptor.

Debido a su dependencia de la distancia, FRET se ha convertido en una especie de "regla molecular" que le permite medir la distancia entre las moléculas, cada una de las cuales está etiquetada con uno de los socios de transferencia.

FRET se puede observar entre fluoróforos de diferente naturaleza química; también es posible utilizar este fenómeno a nivel de moléculas individuales [14] o en un  formato separado ( FRET resuelto en el tiempo ), lo que proporciona información adicional sobre la dinámica y la heterogeneidad de los sistemas moleculares complejos [15] [16] .

Ventajas de los métodos de investigación fluorescentes

Sensibilidad ultra alta

En cuanto a su sensibilidad, la fluorescencia es una campeona absoluta, superando a los métodos de detección basados ​​en la absorción de la luz o el uso de la desintegración radiactiva [1] . Los instrumentos modernos pueden identificar moléculas fluorescentes individuales. Esto contribuyó al desarrollo de un área separada: la espectroscopia de fluorescencia molecular única (SFS, inglés ,  Single Molecule Fluorescence Spectroscopy ) [17] [18] . La espectroscopia de fluorescencia unimolecular ha abierto nuevas posibilidades para el estudio de sistemas biológicos a nivel molecular. Por ejemplo, los métodos clásicos para estudiar biomoléculas , como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear , tratan con muestras grandes que contienen una gran cantidad de moléculas, por lo que debe lidiar con una señal promedio todo el tiempo. Otros métodos, como la microscopía electrónica , permiten la observación física de moléculas individuales; sin embargo, dichos métodos no permiten estudiarlos en condiciones biológicamente relevantes. La espectroscopia de fluorescencia de molécula única se ha convertido en un método de investigación importante, que combina la capacidad de observar moléculas individuales con la capacidad de estudiarlas en dinámica y en condiciones biológicamente relevantes. Por ejemplo, es gracias a OFS que se hizo posible estudiar el plegamiento y la dinámica de proteínas y ADN a nivel de moléculas individuales [14] [19] [20] [21] . Además, sobre la base de OFS, se crearon métodos para secuenciar moléculas de ADN individuales y para observar moléculas fluorescentes individuales en una célula usando microscopía de fluorescencia de ultra alta resolución [22] [23] . Con la ayuda de los métodos modernos de microscopía unimolecular, es posible no solo determinar la posición de las moléculas individuales en una célula con una precisión de varias decenas de nanómetros (lo que supera significativamente las capacidades de la microscopía de luz tradicional ), sino también monitorear sus transformaciones en tiempo real [24] .

Detección múltiplex

Hay un gran número de fluoróforos , cada uno de los cuales se caracteriza por un determinado máximo de emisión (color de fluorescencia). Esto abre la posibilidad de detección multiplex, es decir, para observar varios objetos al mismo tiempo si están codificados por fluoróforos con diferentes colores de emisión. Los espectros de emisión de los fluoróforos no deben superponerse. Si se utilizan fluoróforos de espectro estrecho, como los puntos cuánticos , es posible observar incluso cinco dianas intracelulares simultáneamente [24] .

Compatibilidad con organismos vivos

Es posible realizar estudios mediante fluorescencia en células vivas e incluso en organismos completos [10] . La luz fluorescente visible no es absorbida por macromoléculas biológicas, agua y otros componentes de las células vivas y no afecta los procesos que ocurren en la célula.

En los últimos años se han desarrollado numerosos fluoróforos biocompatibles y sondas fluorescentes. Entre ellas destacan especialmente las proteínas fluorescentes. Gracias a la ingeniería genética, se pueden unir marcadores de proteínas fluorescentes de diferentes colores a las proteínas en varios organismos de laboratorio ( proteínas de fusión en inglés  ). La foto de la derecha muestra ratones que se han insertado en el genoma de eGFP, una proteína fluorescente verde mejorada .

Al visualizar la fluorescencia en tejidos vivos, un cierto problema es la absorción de luz con longitudes de onda cortas. En este sentido, Danio rerio  , un pequeño pez de acuario , que es completamente transparente a la luz visible en las primeras etapas de desarrollo, ha ganado gran popularidad como organismo de laboratorio. Esto lo convierte en un organismo modelo conveniente para estudios que utilizan marcadores y sondas fluorescentes [25] .

Alta velocidad de respuesta

La fluorescencia es un proceso muy rápido que ocurre en una escala de tiempo de nanosegundos (en el caso de complejos metálicos individuales, en una escala de tiempo de microsegundos). En un segundo, una molécula de fluoróforo puede emitir millones de fotones, cada uno de los cuales contiene información sobre el entorno en el que se encontraba la molécula inmediatamente antes de la emisión [11] . Debido a esto, la fluorescencia se usa convenientemente para estudiar procesos rápidos, como el plegamiento y la dinámica de moléculas de proteína individuales [19] .

Alta resolución espacial

La resolución espacial del método indica a qué distancia mínima deben estar los objetos para poder distinguirlos sin ambigüedades. La resolución espacial es muy importante en el estudio de los sistemas vivos a nivel microscópico. El tamaño lineal de las estructuras celulares individuales, como por ejemplo los poros nucleares, puede ser de decenas de nanómetros, lo que las hace inaccesibles a la microscopía óptica clásica .

Debido a algunas características del proceso de fluorescencia, como, por ejemplo, la capacidad de eliminar de forma controlada la emisión no deseada en ciertas áreas de la muestra utilizando irradiación adicional ( eng.  agotamiento de la emisión estimulada ) a finales del siglo XX, los métodos de microscopía óptica de ultra alta resolución ( ing.  microscopía de súper resolución ).

Si para la microscopía de fluorescencia confocal la resolución espacial máxima alcanzable es de unos 200 nm, para los métodos de microscopía de ultra alta resolución ( STED , PALM, etc.) la resolución alcanza varias decenas de nanómetros [26] [27] .

Fluoróforos

No todos los compuestos químicos tienen la capacidad de emitir fluorescencia . Por ejemplo, de veinte aminoácidos proteinogénicos , solo tres tienen propiedades fluorescentes: fenilalanina , tirosina y triptófano [28] . La fluorescencia de este último se usa ampliamente para estudiar las conformaciones, la dinámica y las interacciones de las proteínas que contienen triptófano [1] [28] . Las bases nitrogenadas de purina y pirimidina , que forman parte del ADN y el ARN , casi no emiten fluorescencia en condiciones normales [29] .

Existe una amplia variedad de compuestos fluorescentes artificiales con diferentes propiedades fotofísicas [30] [31] [32] [33] . Las clases principales son pequeños colorantes orgánicos, compuestos de coordinación de lantánidos , proteínas fluorescentes y nanocristales semiconductores. Cada clase tiene sus propias características, ventajas y desventajas específicas.

Pequeños fluoróforos orgánicos

Los fluoróforos orgánicos pequeños son la clase más grande de compuestos fluorescentes. En la mayoría de los casos, estos son compuestos orgánicos relativamente pequeños que contienen pocos restos aromáticos . El peso molecular de la mayoría de los fluoróforos orgánicos es inferior a un kilodalton [11] .

Una gran cantidad de compuestos orgánicos tienen propiedades fluorescentes . Sólo un número limitado de ellos son de importancia práctica, son derivados de varias estructuras básicas [34] . Estos son derivados de la cumarina , fluoresceína [35] , rodamina [35] [36] , complejos de fluoruro de boro de dipirrolilmeteno BODIPY [37] , cianina [38] y escuarina [39] .

El color de fluorescencia de los tintes orgánicos pequeños puede variar en un rango muy amplio. Por ejemplo, los derivados de cumarina y fluoresceína tienen fluorescencia azul y verde, respectivamente. Los derivados de rodamina y BODIPY pueden tener una fluorescencia amarilla-roja, mientras que se han desarrollado colorantes basados ​​en cianinas y escuarinas que emiten fluorescencia en rojo y en el infrarrojo cercano . La fluorescencia del tinte se puede controlar cambiando la naturaleza de los grupos funcionales unidos al fluoróforo [34] .

Otra característica de los fluoróforos orgánicos pequeños es que su fluorescencia se puede "activar" con cambios mínimos en la estructura química. Esto se usa ampliamente en la creación de sondas fluorescentes basadas en tales moléculas. Un ejemplo es la fluoresceína , que puede existir como dos tautómeros : una forma de lactona no fluorescente y una forma abierta fluorescente.

Los compuestos no fluorescentes basados ​​en una forma "cerrada" pueden convertirse en fluorescentes bajo la influencia de ciertos productos químicos [40] .

Existen métodos químicos para apagar y encender la fluorescencia de otros fluoróforos [41] . Tales reactivos que aumentan la fluorescencia bajo ciertas condiciones se denominan "sondas fluorogénicas" [42] .

Una ventaja significativa de los fluoróforos orgánicos es la capacidad de cambiar sus propiedades fotofísicas al variar los grupos funcionales . Otras ventajas son el pequeño tamaño y la posibilidad de marcaje covalente selectivo de biomoléculas . Las desventajas son rendimientos cuánticos de fluorescencia moderados, bajo brillo, baja estabilidad química y fotoblanqueo rápido bajo radiación láser [11] .

Recientemente se han desarrollado nuevas generaciones de colorantes fluorescentes con propiedades mejoradas [43] [44] . La investigación sobre nuevos fluoróforos utiliza métodos modernos de química orgánica , como la síntesis orgánica combinatoria [45] .

Compuestos de coordinación

Las propiedades fluorescentes son inherentes a algunos cationes metálicos del grupo de los lantánidos (Ln 3+ ). De la absorción y emisión de luz por parte de estos átomos, son responsables las transiciones de electrones del subnivel f, que en la mayoría de los casos están prohibidas mecánicamente cuánticamente [11] . Por lo tanto, la fluorescencia de los lantánidos tiene ciertas características, en particular, tiempos de vida muy largos del estado excitado, que son de 3 a 4 órdenes de magnitud más largos que los tiempos de vida de los fluoróforos orgánicos. Debido a la presencia de varias posibles transiciones electrónicas con diferentes energías, los espectros de fluorescencia de los lantánidos presentan un conjunto de bandas individuales características de cada elemento. El color de emisión puede variar desde el azul ( Tm ) hasta el infrarrojo ( Er ) [46] . Normalmente, los lantánidos se utilizan en forma de complejos con ligandos orgánicos , que aumentan la eficiencia de excitación de los átomos metálicos ( sensibilización ).

Proteínas fluorescentes

Un grupo importante de fluoróforos son las proteínas fluorescentes. El primer miembro de esta clase, la proteína fluorescente verde (GFP), se aisló de la medusa Aequorea victoria en 1962 [47] . Es una proteína relativamente pequeña con un peso molecular de 27 kDa que absorbe la luz azul y emite una fluorescencia verde.

En 1996, la estructura tridimensional de GPB salvaje y sus mutantes fue estudiada por difracción de rayos X [48] [49] . Se ha encontrado que la proteína tiene una estructura cilíndrica, que está formada por varias láminas beta . En el centro del cilindro hay un fluoróforo, que se forma debido a una reacción química entre los residuos de aminoácidos de serina , tirosina y glicina (aminoácidos 65-67).

Los estudios han demostrado que el plegamiento de la cadena polipeptídica GPB en una estructura cilíndrica y la formación de un fluoróforo funcional es un proceso espontáneo y no requiere modificaciones postraduccionales ni cofactores, excepto el oxígeno molecular [50] [51] . Como resultado, los GFB se pueden expresar con éxito a través de la ingeniería genética en muchos organismos que no tienen proteínas fluorescentes de forma natural.

También se ha desarrollado una tecnología para utilizar GFP como proteína marcadora que se puede unir a otra proteína intracelular. Si combina el gen GFB con el gen que codifica una proteína específica, después de la transcripción y traducción , se forma una nueva proteína híbrida que consta de dos partes. En este caso, la parte ZFB se convertirá de forma independiente en una estructura cilíndrica compacta con un fluoróforo en su interior. Dado que GFP es una proteína bioquímicamente inerte relativamente pequeña, es muy probable que no interfiera con su "socio" para que no realice sus funciones en la célula. Pero al mismo tiempo, toda la estructura híbrida emitirá una intensa fluorescencia, lo que permitirá observar su formación y movimiento [50] . Por ejemplo, si el gen GFB se introduce en los genes que codifican las proteínas del citoesqueleto , estas últimas comenzarán a emitir una intensa fluorescencia [52] .

Se obtuvieron proteínas fluorescentes con propiedades mejoradas mediante la sustitución de aminoácidos individuales en GFP salvaje por mutagénesis . Por ejemplo, el cambio de aminoácidos individuales del entorno del fluoróforo dio mutantes con diferentes colores de fluorescencia ( azul , amarillo , rojo e infrarrojo) [53] [54] . También fue posible obtener variantes de GFP con menor tiempo para la formación de una forma fluorescente (maduración), con mayor fotoestabilidad y rendimientos cuánticos de fluorescencia.

Se han desarrollado proteínas fluorescentes fotoactivadas (proteínas fluorescentes fotoconmutables  ) que pueden "encenderse" y "apagarse" mediante la irradiación con luz de un determinado color [55] [56] .

Sobre la base de proteínas fluorescentes, se han desarrollado sensores fluorescentes genéticamente programables [57] [58] . Además, las proteínas fluorescentes han encontrado una amplia aplicación en la espectroscopia de fluorescencia de ultra alta resolución [59] .

El impacto revolucionario de las proteínas fluorescentes en la biología y la biotecnología modernas fue reconocido por el Premio Nobel de Química de 2008 , otorgado a Osamu Shimomura , Martin Chalfi y Roger Tsien [60] .

Nanopartículas fluorescentes y nanoclusters

Otro grupo de compuestos fluorescentes son los nanocristales semiconductores o puntos cuánticos . Con una disminución en el tamaño físico de las partículas de semiconductores a nanómetros, comienzan a exhibir propiedades que difieren de las de los semiconductores a granel. En particular, estamos hablando de efectos cuánticos. Cuando un punto cuántico interactúa con la radiación electromagnética , se forma un excitón , que queda encerrado en un pozo de potencial. La recombinación de un excitón conduce a la liberación de energía. Debido a esto, las partículas de tamaño nanométrico formadas a partir de sustancias semiconductoras como el seleniuro de cadmio (CdSe) pueden absorber la luz y emitir fluorescencia [11] .

Debido a la diferencia en la estructura química y la naturaleza del estado electrónico fundamental y excitado, las propiedades fotofísicas de los puntos cuánticos difieren de las de los fluoróforos orgánicos y las proteínas fluorescentes. En primer lugar, los puntos cuánticos dan un espectro de emisión estrecho y simétrico , cuya posición máxima depende del diámetro del punto cuántico y del material del que está formado. Al variar la concentración de reactivos durante la síntesis, es posible lograr la formación de puntos cuánticos predominantemente del mismo diámetro, que tendrán su propio color de fluorescencia específico. Por ejemplo, para CdSe, cambiar el tamaño del núcleo de 13 a 24 nanómetros conduce a un cambio en la fluorescencia de azul ( λem = 500 nm) a rojo ( λem = 610 nm) [11] . Es importante que la forma del espectro de excitación de fluorescencia no dependa del diámetro; esto significa que es posible lograr la excitación simultánea de diferentes tipos de puntos cuánticos usando solo una onda de excitación, lo cual es muy conveniente para su uso en microscopía de fluorescencia .

Otras ventajas de los puntos cuánticos sobre los tintes fluorescentes orgánicos son los altos rendimientos cuánticos de fluorescencia y la alta resistencia al fotoblanqueo [11] .

Al mismo tiempo, los puntos cuánticos también tienen una serie de desventajas. En primer lugar, se trata de grandes dimensiones físicas, que superan el tamaño de la mayoría de las moléculas biológicas . En segundo lugar, los materiales de los que están hechos los puntos cuánticos ( Cd , Pb , Se , Hg ) son muy tóxicos para las células y los organismos vivos [61] . Para reducir la toxicidad, se aplica un diseño de puntos cuánticos de varias etapas. El núcleo semiconductor ( eng.  core ) está cubierto con una capa protectora doble de un material relacionado (para seleniuro de cadmio, este material es sulfuro de zinc ) y una capa de polímero hidrofílico , lo que aumenta la solubilidad de un punto cuántico en un medio acuoso y hace es posible unir químicamente otras moléculas a la superficie [62] .

Los puntos cuánticos se utilizan ampliamente en microscopía de fluorescencia y diagnóstico molecular in vitro [63] ; también se están desarrollando métodos para su uso en imágenes moleculares y diagnósticos in vivo .

Además de los puntos cuánticos, existen otras partículas fluorescentes de tamaño nanométrico. Un ejemplo son las nanopartículas de silicio con tintes orgánicos unidos covalentemente a la superficie [64] , que tienen una toxicidad significativamente menor en comparación con los puntos cuánticos. También se conocen nanopartículas formadas a partir de compuestos orgánicos poliméricos [65] . Otro ejemplo son los nanoclusters de oro y plata sintetizados en una matriz de ADN , que exhiben propiedades fluorescentes y consisten en solo unos pocos átomos de metal [66] [67] .

Sondas fluorescentes y etiquetas

Las sustancias fluorescentes utilizadas en biología se pueden dividir en dos grandes grupos: sondas fluorescentes y etiquetas fluorescentes [11] [68] :

Etiquetas fluorescentes

Las etiquetas fluorescentes más comunes en biología celular y molecular son las proteínas fluorescentes. El marcaje con proteína fluorescente verde y sus análogos es un procedimiento de rutina que se utiliza para estudiar la estructura y función de las proteínas en varios organismos modelo.

Hoy en día, gracias a la combinación de tecnologías para el marcaje selectivo de proteínas con GFB, microscopía automática de alto rendimiento y análisis de imágenes asistido por computadora, es posible estudiar la localización y funciones de cientos de proteínas diferentes en paralelo [69] .

Las proteínas fluorescentes no se pueden utilizar directamente para el marcaje covalente de ácidos nucleicos . Para examinar el ADN y el ARN utilizando marcadores de proteínas fluorescentes, se utiliza la siguiente técnica. En la cadena de ácido nucleico se introduce una secuencia con la que se une selectivamente una determinada proteína (represor, factor de transcripción , etc.). La propia proteína se marca con la proteína fluorescente deseada. Las proteínas relacionadas con el ADN y el ARN marcadas con fluorescencia se unen a sus objetivos, mostrando su localización espacial. La implementación práctica de esta estrategia es la visualización de ADN en células eucariotas usando el represor de lactosa GFP ( ing.  GFP-lac represor ) [70] para la visualización de ARN usando el sistema λ N [71] .

Sondas fluorescentes

De acuerdo con su nombre, la sonda fluorescente tiene como finalidad transmitir al investigador información sobre el entorno en el que se encuentra. Una sonda fluorescente es una construcción molecular que cambia uno de los parámetros de fluorescencia (intensidad, tiempo de vida , máximo del espectro de fluorescencia) cuando se une a su objetivo. Las sondas fluorescentes son una herramienta conveniente para visualizar y cuantificar la distribución de sustancias químicas , como las moléculas de señalización en las células [72] .

Una sonda fluorescente consta de dos componentes principales: 1) un receptor que se une a la molécula a marcar (en química analítica se denomina analito ); 2) un fluoróforo que reacciona a un cambio en el medio ambiente cambiando su fluorescencia [11] . Hay un gran número de mecanismos que pueden transformar la unión entre el receptor y el analito en un cambio en la señal fluorescente. Por ejemplo, cuando un receptor se une a un analito, la conformación de la molécula puede variar, lo que conduce a una elongación o contracción del sistema de enlaces π conjugados [73] . Un cambio en la conformación de la molécula puede afectar la distancia entre el par FRET , lo que también dará lugar a cambios notables en la fluorescencia. La formación de nuevos enlaces de coordinación entre el receptor y el analito puede activar/bloquear la transferencia de electrones fotoinducida , que es uno de los mecanismos de extinción de la fluorescencia [74] .  También existen otros mecanismos [75] .

Una sonda fluorescente puede cambiar la fluorescencia de diferentes maneras cuando se une a un analito, que se muestra esquemáticamente en la figura: la fluorescencia puede aumentar (caso A ), disminuir ( B ) o cambiar completamente uno de los parámetros, por ejemplo, el color (caso C ).

Ejemplos para el primer caso (crecimiento de fluorescencia en presencia de un analito) son numerosos derivados de fluoresceína y rodamina en forma de lactona cerrada . La apertura de las lactonas para formar una forma fluorescente abierta al reaccionar con sustancias como el peróxido de hidrógeno, el sulfuro de hidrógeno o el óxido nítrico (NO) es un método para detectar estas moléculas biológicamente importantes en los organismos vivos [76] . Un ejemplo para el segundo caso (una disminución de la fluorescencia tras la interacción con un analito) son las sondas fluorescentes para iones de cloruro : la fluorescencia de muchos derivados de quinolina disminuye en presencia de iones de cloruro [1] . Finalmente, un ejemplo para el tercer caso es Fura-2, una de las primeras sondas radiométricas para iones de calcio [77] , que cambia el color de la fluorescencia con un cambio en la concentración de iones Ca 2+ en el medio.

En algunos casos, la sonda fluorescente no responde a la presencia de algún químico en particular, sino a un cambio en los parámetros físicos del ambiente en el que se encuentra ( temperatura , polaridad , viscosidad ). Un ejemplo importante son los colorantes fluorescentes solvatocrómicos, compuestos que cambian el color de la fluorescencia según la polaridad del entorno. Los colorantes fluorescentes solvatocrómicos se han convertido en una herramienta importante para estudiar la composición lipídica y las transiciones de fase en las membranas celulares lipídicas [78] . Otro grupo de compuestos, que se denominan rotores moleculares fluorescentes , cambia la intensidad de la fluorescencia en función de la viscosidad del medio. La intensidad de fluorescencia es muy baja en disolventes ordinarios, mientras que a valores elevados de la viscosidad dinámica del medio, la intensidad de fluorescencia aumenta diez veces [79] . Con la ayuda de rotores moleculares fluorescentes y microscopía de fluorescencia confocal , fue posible estudiar la viscosidad del medio dentro de las células vivas [80] . En los últimos años, las sondas fluorescentes se han convertido en herramientas indispensables para el estudio de células vivas, enriqueciendo la biología celular con nuevos métodos rápidos y precisos de análisis cuantitativo [81] [82] .

Ejemplos de uso de fluorescencia

Secuenciación de ADN

La secuenciación se refiere a la determinación de la secuencia de nucleótidos en una cadena de ácido nucleico [83] . Los primeros métodos de secuenciación se desarrollaron en la década de 1970 del siglo XX. Eran el método de degradación química de Maxam-Gilbert [84] y el método basado en el uso de terminadores dideoxi según Sanger [85] . La esencia de este último era la extensión enzimática de un cebador (un oligonucleótido corto -semilla de estructura conocida) sobre una molécula de ADN de secuencia desconocida en presencia de nucleósidos especiales químicamente modificados  , terminadores didesoxi. Son similares a los trifosfatos de nucleósidos convencionales, que son los compuestos iniciales para la síntesis de ADN en el cuerpo, pero se diferencian de ellos en la ausencia de un grupo 3'-hidroxilo. Estos compuestos químicos pueden incorporarse a una secuencia de ADN que es sintetizada por la ADN polimerasa . Pero después de la incorporación del terminador didesoxi, la síntesis se interrumpe debido a la falta de un 3'-hidroxilo libre para la formación de un nuevo enlace fosfodiéster con el nucleósido subsiguiente.

El método original de Sanger utilizaba la extensión enzimática de un cebador marcado radiactivamente ( 32P en el grupo hidroxilo 5') en cuatro tubos diferentes. A cada uno se añadió un pequeño porcentaje de un terminador didesoxi específico. Por ello, la síntesis en cada probeta se interrumpía en un momento determinado, pero siempre en la posición del nucleótido que estaba en forma de terminador didesoxi. Aparte del uso de isótopos radiactivos, otra desventaja de este método era la gran cantidad de operaciones requeridas para detectar y leer la señal radiactiva, así como la necesidad de utilizar cuatro carriles para cada análisis, ya que era imposible distinguir entre diferentes terminados. fragmentos sólo por su radiactividad.

El método de secuenciación del terminador dideoxi mejoró significativamente cuando el marcaje radiactivo del cebador se reemplazó por el marcaje fluorescente de los nucleótidos terminales. La figura muestra la estructura de los didesoxinucleósidos trifosfatos, que contienen tintes fluorescentes unidos por enlaces covalentes a bases nitrogenadas . Se ha descubierto que tales modificaciones de bases nitrogenadas tienen un efecto mínimo en el reconocimiento de trifosfatos por parte de las ADN polimerasas , por lo que pueden insertarse en el ADN sintetizado junto con los dNTP convencionales. En el caso de los terminadores didesoxi fluorescentes, cuando se termina la síntesis de ADN, se marca con fluorescencia. El uso de colorantes fluorescentes de cuatro colores para codificar cada uno de los nucleósidos naturales hizo posible realizar la síntesis en un tubo y la separación en un carril del gel. Además, la detección fluorescente demostró ser más sensible y rápida que la detección radiactiva, lo que permitió la determinación de nucleótidos en tiempo real.

Como resultado, a fines de la década de 1980, fue posible desarrollar sistemas automáticos para la secuenciación de ADN con la separación de fragmentos terminados en la versión capilar de electroforesis en gel y con la detección de cada “letra” en la secuencia por su color de fluorescencia específico.

Aunque fue gracias a este método que se descifró una parte importante del ADN humano, la secuenciación de Sanger ya no es relevante debido a la existencia de métodos más rápidos, económicos y efectivos de las nuevas generaciones. Muchos de ellos también se basan en la detección de fluorescencia. Por ejemplo, la secuenciación por  síntesis también utiliza la codificación con cuatro colores de fluorescencia diferentes para cada una de las cuatro letras del código genético [86] .

Hibridación de ADN

Las moléculas de ADN están formadas por dos cadenas de polinucleótidos que son complementarias entre sí. Las bases nitrogenadas de las dos cadenas forman pares que se estabilizan mediante enlaces de hidrógeno . Un rasgo característico de los ácidos nucleicos es la capacidad de reconocimiento molecular, debido a que los fragmentos de ADN monocatenarios tienen afinidad por los fragmentos complementarios.

Basados ​​en el fenómeno de la hibridación , se han creado métodos para el análisis de secuencias de ácidos nucleicos utilizando oligonucleótidos sintéticos marcados con fluorescencia.

Uno de ellos es la hibridación fluorescente in situ ( FISH ), que se utiliza para identificar la localización exacta de ciertas secuencias de ADN en los cromosomas en metafase [1] . La hibridación fluorescente in situ utiliza oligonucleótidos de sonda sintéticos. Cada secuencia de sonda está unida covalentemente a un fluoróforo de color específico . Estas sondas se introducen en las células, después de lo cual permanecen durante un cierto tiempo para que se produzca la hibridación entre las sondas y las regiones complementarias del ADN cromosómico. Las sondas que no se han hibridado se eliminan mediante lavado, después de lo cual se examina la coloración característica de los cromosomas mediante microscopía de fluorescencia .  

Además de la localización de genes individuales en los cromosomas, FISH permite estudiar la colocalización de fragmentos de ADN. Debido a esto, el método es útil para citología y genética . Por lo tanto, si se utilizan dos sondas marcadas con fluoróforos rojos y verdes para la hibridación con el ADN cromosómico, los sitios de colocalización de estas secuencias en los cromosomas se verán como puntos amarillos [1] .

A menudo, la tarea es determinar si la secuencia de ADN de la estructura deseada está contenida en una solución , por ejemplo, en un extracto celular o en una mezcla de productos de reacción en cadena de la polimerasa . La hibridación fluorescente in situ no es adecuada para esto, porque cuando el ADN marcado se une a la diana, no habrá cambios en la fluorescencia y es imposible separar la sonda unida de la no unida, como en el caso de los cromosomas, debido a su idéntica solubilidad y otras propiedades fisicoquímicas.

Un método elegante para resolver este problema se encontró en 1996 [87] y se denominó "balizas moleculares" ( ing.  molecular beacons probes, MB-probes , rus. MM-probes ). La estructura y el principio de funcionamiento de las sondas MM se muestran en la figura.

La sonda MM es un fragmento de ADN monocatenario que consta de dos secciones: un bucle ( rojo en la figura ) y una base (negro). La secuencia de nucleótidos en el bucle se elige para que sea complementaria a la secuencia a designar (objetivo). Las dos partes de la base son complementarias entre sí y por lo tanto forman una estructura estable en ausencia de un objetivo. Los grupos hidroxilo terminales del ADN monocatenario se modifican covalentemente con un fluoróforo (F) en un lado y un extintor de fluorescencia (Q) en el otro. En ausencia de un objetivo, la sonda está en un estado cerrado: el fluoróforo y los extintores están uno al lado del otro, por lo que la fluorescencia está "apagada". En presencia de un ADN objetivo, se puede formar una estructura híbrida en la que el bucle central es complementario al objetivo, por lo que la sonda MM se "abre". En este estado, los extremos, que inicialmente formaban la base de la sonda, están separados por una distancia considerable en el espacio. En consecuencia, en este estado, los extintores no pueden extinguir eficazmente el fluoróforo, lo que conduce a un aumento significativo de la intensidad de la fluorescencia [87] .

El método de marcaje de ADN original con sondas de MM ha experimentado numerosas mejoras [88] . Por ejemplo, hay modificaciones que se basan en el uso de transferencia de energía resonante. En lugar de un par fluoróforo-apagador, los extremos de una sonda de ADN monocatenario están marcados con dos fluoróforos que forman un par FRET ; debido a esto, la presencia de una diana de ADN puede determinarse por la desaparición de la fluorescencia del aceptor y el aumento de la fluorescencia del donante [89] [90] .

Un importante campo de aplicación de las sondas MM se ha convertido en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCR). Una sonda MM complementaria a la región central de la secuencia a amplificar se añade a la mezcla de reacción antes del inicio de la reacción . Después del inicio de la reacción, se mide la intensidad de fluorescencia en cada ciclo de amplificación. Si como resultado de la PCR se amplifica un fragmento complementario a la sonda, la intensidad de la fluorescencia aumenta en proporción a la concentración del producto en la mezcla. Gracias a esto, es posible estimar la cantidad de ADN original que había al comienzo de la amplificación. Además, es posible observar la amplificación de varias variantes de la secuencia de ADN en una mezcla usando una combinación de sondas MM codificadas con diferentes colores de fluorescencia. Esta técnica ha encontrado uso en el análisis genético para identificar diferentes alelos de un solo gen [91] [92] .

En la microscopía de fluorescencia , las sondas MM se utilizan para estudiar el nivel de expresión génica mediante la visualización del ARNm en el citoplasma . Cuando un determinado gen comienza a transcribirse , la concentración del ARNm correspondiente aumenta en el citoplasma. Si se sintetiza una sonda de MM con un bucle que es complementario a una región de ARNm, dicha sonda se hibridará con ella, al tiempo que aumenta su intensidad de fluorescencia. Debido a esto, es posible averiguar la localización del ARNm correspondiente en la célula y evaluar el nivel de expresión por el crecimiento de la fluorescencia [93] [94] [95] .

Micromatrices de ADN

Los organismos de los eucariotas superiores contienen miles de genes, cuyo trabajo total determina el fenotipo del organismo. La tecnología de micromatrices de ADN [96] se ha desarrollado para el estudio rápido y simultáneo de un gran número de genes .

Una micromatriz de ADN es una superficie sólida sobre la que se depositan una gran cantidad de oligonucleótidos individuales . Cada elemento de la matriz en la superficie contiene el ADN de una estructura específica, que se programa cuando se crea la matriz. Uno de los métodos para crear micromatrices de ADN es la síntesis química de ADN en fase sólida utilizando grupos protectores fotoactivos [97] .

Esta tecnología resultó conveniente para analizar el nivel de expresión génica en las células. Esto requiere una micromatriz de ADN que contenga un conjunto de marcadores de oligonucleótidos específicos para cada uno de los genes a investigar. Para comparar el nivel de expresión en dos muestras, control y estudio, se realizan las siguientes operaciones.

Las células de ambas muestras se tratan con productos químicos especiales y se extrae el ARN mensajero, que está contenido en el citoplasma. El ARN de cada muestra se incuba en presencia de transcriptasa inversa y marcadores fluorescentes de un determinado color, lo que da como resultado la formación de moléculas de ADNc marcadas con fluorescencia . Entonces, por ejemplo, en la figura, el ADNc de la muestra A se marcó con un fluoróforo rojo y el ADNc de la muestra B se marcó con  verde. Después de eso, las muestras se mezclan e hibridan en el microarreglo. Como resultado, las moléculas de ADNc hibridan en una célula que coincide con su gen. El análisis del color de la fluorescencia en cada célula muestra la diferencia en el nivel de expresión del gen correspondiente en ambas muestras. Si la celda es roja, significa que cuando la solución se hibridó en la micromatriz, contenía más ADNc de las células A , por lo tanto, el nivel de expresión génica en las células A fue mayor. Si la celda es verde, entonces el nivel de expresión fue mayor en las células B. Finalmente, el color amarillo indica que las células contenían la misma cantidad de ARNm , por lo tanto, tenían el mismo nivel de expresión de este gen [96] .

Microscopía de fluorescencia

Métodos para la tinción fluorescente de células

Colorantes orgánicos fluorescentes de bajo peso molecular para organelos celulares

Algunos colorantes orgánicos de bajo peso molecular muestran afinidad por determinadas biomoléculas u orgánulos de células completas . Este fenómeno se utiliza para la tinción multicolor selectiva de células en microscopía de fluorescencia. En la tabla se dan algunos ejemplos de colorantes.

Nombre Fórmula estructural Color de fluorescencia Qué colores
DAPI
4',6-diamidino-2-fenilindol		 azul ADN nuclear
Hoechst 33342 azul ADN nuclear
Rojo Nilo (Nilo Rojo) rojo elementos lipofílicos de las células ( membranas , liposomas )
MitoRojo rojo mitocondrias

Uno de los colorantes más comunes para el ADN nuclear es el 4',6-diamidino-2-fenilindol, DAPI. Es capaz de unirse selectivamente al ADN en las regiones ricas en AT, exhibiendo un pico de fluorescencia azul brillante a 461 nm [98] . La capacidad de teñir el ADN cromosómico se demuestra con compuestos como Hoechst 33342, así como con algunos tintes de cianina [99] . También hay tintes fluorescentes que tiñen preferentemente los G-quadruplex [100] .

Las mitocondrias tienen un alto potencial de membrana negativo (alrededor de -180 mV), por lo que pueden teñirse selectivamente con colorantes fluorescentes catiónicos como MitoRed [101] .

Tinción inmunofluorescente

Una desventaja importante del uso de compuestos orgánicos pequeños como tintes fluorescentes es la baja selectividad del marcaje de los componentes celulares. Por ejemplo, los compuestos que se unen al ADN cromosómico pueden, en diversos grados, teñir otros ácidos nucleicos contenidos en la célula; los tintes lipofílicos que tiñen las membranas lipídicas también pueden unirse a sitios hidrófobos en las proteínas.

El marcaje fluorescente selectivo de las estructuras intracelulares puede lograrse mediante la tinción inmunofluorescente de las células. Este método combina la selectividad de los métodos tradicionales de inmunotinción con la sensibilidad de la detección por fluorescencia.

Al igual que la inmunotinción clásica, este método se basa en el uso de anticuerpos. Los anticuerpos  son moléculas de proteínas que se unen con alta afinidad y selectividad a sus objetivos. Cada anticuerpo reconoce su antígeno específico .

Con la tinción inmunofluorescente, se usan dos tipos de anticuerpos a la vez. El anticuerpo primario se une directamente al objeto de la mancha. Posteriormente, el anticuerpo secundario, que se modifica covalentemente con una molécula de fluoróforo , se une al anticuerpo primario. Así, la diana que portará el antígeno quedará teñida debido a la formación de un complejo con dos anticuerpos [11] .

El uso de dos anticuerpos, primario y secundario, es necesario para asegurar la flexibilidad del método, es decir, en aras de poder variar los colores de diferentes dianas sin necesidad de obtener y modificar químicamente nuevos anticuerpos.

La desventaja de la tinción inmunofluorescente es la baja permeabilidad de los anticuerpos a través de las membranas celulares . Como resultado, este método se usa con mayor frecuencia para teñir células fijadas.

Proteínas autofluorescentes

Las proteínas autofluorescentes genéticamente programadas basadas en la proteína fluorescente verde (GFP) y sus análogos son marcadores fluorescentes indispensables en biología celular y molecular .

La ventaja de las proteínas autofluorescentes es la capacidad de visualizarlas en una célula sin la introducción de colorantes o productos químicos adicionales . El etiquetado genético de proteínas celulares con marcadores de proteínas fluorescentes se puede implementar sin cambiar la conformación y las propiedades bioquímicas de la proteína marcada. Como resultado, el marcaje de proteínas GFB se utiliza para estudiar el nivel de expresión de proteínas en las células [102] .

Además de los marcadores fluorescentes pasivos, que simplemente señalan la presencia y localización de la proteína a la que están unidos, se han creado sondas fluorescentes basadas en GFP que cambian la fluorescencia según la concentración de iones, moléculas señalizadoras y otros factores ambientales en los que se encuentran [103] .

En 2019 se construyó una nueva proteína fluorescente CagFbFP, caracterizada por un tamaño pequeño (consta de 107 aminoácidos y un peso molecular de 11,6 kDa) y estabilidad térmica (no cambia de propiedades hasta +68°C) [104] . Esta proteína, debido a su estabilidad y facilidad de cristalización, es un modelo prometedor para estudios estructurales como marcador para microscopía de fluorescencia ultraprecisa de alta resolución en el estudio de tumores malignos. El prototipo para la síntesis de una nueva proteína fluorescente fue la bacteria termófila Chloroflexus aggregans , que se encuentra en las aguas termales de la isla de Honshu, que vive en aguas muy calientes con mínimas trazas de oxígeno.

Microscopio de fluorescencia

La microscopía de fluorescencia requiere microscopios especialmente diseñados [105] . En la figura se muestra un diagrama muy simplificado de dicho microscopio (es decir, un diagrama de un microscopio epifluorescente confocal de barrido). Tiene las siguientes características estructurales [11] [105] :

  • Las fuentes de luz son láseres o una combinación de fuentes de luz convencionales y monocromadores . Esto permite irradiar selectivamente la muestra con luz de cierta longitud de onda para excitar fluoróforos del mismo tipo.
  • El uso de un espejo translúcido simplifica el diseño al permitir que se use el mismo camino óptico para la luz de excitación (líneas verdes en la figura) y fluorescente (líneas rojas). A diferencia de la microscopía clásica, en la que toda la muestra se irradia simultáneamente, estos microscopios de epifluorescencia dirigen la luz de excitación solo a la parte de la preparación que está directamente en el campo de visión. Todas las demás partes de la imagen permanecen en la oscuridad. Esto minimiza el fotoblanqueo de fluoróforos inestables y reduce los efectos fototóxicos.
  • La calidad de la imagen mejora significativamente cuando se utilizan microscopios de fluorescencia confocales . En tales microscopios, se instala una rendija en el camino de la luz fluorescente, a través de la cual es posible observar la fluorescencia solo de la parte de la muestra que está en el foco de la imagen. Con la ayuda de microscopios fluorescentes confocales, es posible cambiar la profundidad de penetración en la célula al observar sus "secciones" individuales (físicamente, la célula permanece intacta). También permite realizar una reconstrucción 3D de la célula acumulando un número suficiente de "rebanadas" ópticas.
  • El uso de un fotomultiplicador como detector permite detectar fotones individuales , lo que aumenta significativamente la sensibilidad del método.
  • En un microscopio de fluorescencia de barrido, una computadora crea una imagen después de escanear la muestra. La luz láser se dirige a cada punto de la imagen por turnos; mientras que el software del microscopio registra la intensidad de la fluorescencia y la correlaciona con las coordenadas del punto de donde se obtuvo. Después de escanear todos los puntos en el campo de visión, la imagen se reconstruye en la pantalla de la computadora.

Además de los microscopios confocales de barrido, existen otros tipos de estos instrumentos.

Microscopía de fluorescencia de ultra alta resolución

En un microscopio confocal de barrido fluorescente , se crea una imagen moviendo secuencialmente el rayo láser de un punto a otro en el cuadro, registrando la fluorescencia y luego reconstruyendo la imagen en una computadora. Resulta que este método tiene algunas desventajas. El fenómeno de la difracción impone ciertas restricciones físicas sobre el tamaño mínimo de un rayo láser enfocado y, en consecuencia, sobre la resolución espacial máxima del método.

Posteriormente, resultó que esta barrera de difracción se puede superar mediante muchos métodos diferentes, lo que abrió oportunidades para la microscopía de fluorescencia óptica de ultra alta resolución [106] [107] .

Uno de los primeros métodos fue la microscopía STED (microscopía basada en la supresión de la emisión espontánea). Este método se basa en la interacción de fluoróforos excitados por un pulso láser convencional con un pulso STED posterior. Si las moléculas de fluoróforo excitadas se irradian con un pulso electromagnético que corresponde en energía a la energía de fluorescencia esperada, se produce una supresión forzada de la emisión. Los fluoróforos que han sido golpeados por un pulso STED no pueden emitir fluorescencia. Al variar las fases de los pulsos excitatorios y STED, se puede obtener su diferente localización en el espacio. Así, la figura de la derecha muestra la proyección del pulso láser inicial, la forma del pulso STED y el área que contiene los fluoróforos excitados después de la superposición de dos pulsos.

Debido a esto, se redujo el área desde la cual se registra la fluorescencia y, en consecuencia, se incrementó la resolución espacial del método. La fotografía de la izquierda muestra, a modo de comparación, dos imágenes del mismo objeto tomadas mediante microscopía confocal de barrido y STED.

Véase también

Notas

  1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Joseph R. Lakowicz Principios de espectroscopia de fluorescencia. - Springer Science + Business Media, 2006. - ISBN 978-0-387-31278-1
  2. ^ 1 2 Principios y aplicaciones de la fluorescencia molecular de Bernard Valeur. Wiley-VCH Verlag GmbH. — ISBN 3-527-29919-X
  3. ↑ Millar, David P Estudios de fluorescencia de la estructura y la dinámica del ADN y el ARN // Opinión actual en biología estructural 6 (1996) págs. 322-326. DOI:10.1016/S0959-440X(96)80050-9.
  4. ↑ Royer, CA Probeing Protein Folding and Conformational Transitions with Fluorescence // Chemical Reviews 106 (2006) (5) págs. 1769-1784. DOI:10.1021/cr0404390.
  5. ↑ Smith, LM, Sanders, JZ, Kaiser, RJ, Hughes, P., Dodd, C., Connell, CR, Heiner, C., Kent, SBH y Hood, LE (1986). Detección de fluorescencia en el análisis automatizado de secuencias de ADN. Naturaleza, 321(6071), 674-679.
  6. ↑ Prober, JM, Trainor, GL, Dam, RJ, Hobbs, FW, Robertson, CW, Zagursky, RJ, Cocuzza, AJ, Jensen, MA y Baumeister, K. (1987). Un sistema para la secuenciación rápida de ADN con didesoxinucleótidos fluorescentes que terminan la cadena. Ciencia, 238(4825), 336-341.
  7. ↑ Shendure, J. y Ji, H. (2008). Secuenciación de ADN de última generación. Nature Biotechnology, 26(10), 1135-1145.
  8. ↑ McGinn, S. y Gut, IG (2012). Secuenciación de ADN - abarcando generaciones. nueva biotecnología.
  9. ↑ Schepartz, A.; González, RL Imágenes moleculares: sine labore nihil // Opinión actual en biología química 15 (2011) pp. 749-751. DOI:10.1016/j.cbpa.2011.11.001.
  10. ↑ 1 2 Drummen, GPC Fluorescent Probes and Fluorescence (Microscopic) Techniques - Illuminating Biological and Biomedical Research // Molecules 17 (2012) pp. 14067-14090. DOI:10.3390/moléculas171214067.
  11. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Alexander P. Demchenko Introducción a la detección de fluorescencia. - Springer Science + Business Media BV, 2009. - ISBN 978-1-4020-9002-8
  12. ↑ Udenfriend, S. Desarrollo del espectrofotofluorómetro y su comercialización // Protein Science 4 (1995) (3) pp. 542-551. DOI:10.1002/pro.5560040321.
  13. ↑ E. V. Kudryashova, A. K. Gladilin, A. V. Levashov Proteínas en ensamblajes supramoleculares: estudio de la estructura por el método de anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo // Uspekhi biologicheskoi khimii 42 (2002) pp. 257-294.
  14. ↑ 1 2 Weiss, S. Medición de la dinámica conformacional de biomoléculas mediante espectroscopia de fluorescencia de una sola molécula // Nature Structural Biology 7 (2000) (9) págs. 724-729. DOI:10.1038/78941.
  15. ↑ Selvin, P. R. El renacimiento de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia // Nature Structural Biology 7 (2000) (9) págs. 730-734. DOI:10.1038/78948.
  16. ↑ Klostermeier, D., Millar, D. P Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo: una herramienta versátil para el análisis de ácidos nucleicos // Biopolímeros 61 (2002) (3) pp. 159-179. DOI:10.1002/bip.10146.
  17. ↑ Ambrose, WP, Goodwin, PM, Jett, JH, Van Orden, A., Werner, JH y Keller, RA Espectroscopia de fluorescencia de molécula única a temperatura ambiente // Chemical Reviews 99 (1999) (10) págs. 2929-2956 . DOI:10.1021/cr980132z.
  18. ↑ Tinnefeld, P. y Sauer, M. Ramificación de la espectroscopia de fluorescencia de una sola molécula: desafíos para la química e influencia en la biología. // Angewandte Chemie International Edition 44 (2005) págs. 2642-2671. DOI:10.1002/anie.200300647.
  19. ↑ 1 2 Haran, G. Espectroscopía de fluorescencia de molécula única de plegamiento biomolecular // Journal of Physics: Condensed Matter 15 (2003) pp. 1292-1313. DOI:10.1088/0953-8984/15/32/201.
  20. ↑ Ha, T. Métodos de fluorescencia de molécula única para el estudio de ácidos nucleicos // Opinión actual en biología estructural 11 (2001) pp. 287-292. DOI:10.1016/S0959-440X(00)00204-9.
  21. ↑ Michalet, X., Weiss, S. y Jäger, M. Estudios de fluorescencia de molécula única del plegamiento de proteínas y la dinámica conformacional // Chemical Reviews 106 (2006) (5) págs. 1785-1813. DOI:10.1021/cr0404343.
  22. ↑ Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M. y Kapanidis, A.N. Navegando en una nueva ola de métodos de fluorescencia de molécula única // Biología física 7 (2010) (3) C. 031001. DOI: 10.1088/ 1478-3975/7/3/031001.
  23. ↑ Moerner, WE; Fromm, DP Métodos de espectroscopía y microscopía de fluorescencia de una sola molécula // Review of Scientific Instruments 74 (2003) pp. 3597-3619. DOI:10.1063/1.1589587.
  24. ↑ 1 2 Persson, F., Barkefors, I. y Elf, J. Métodos de molécula única con aplicaciones en células vivas // Opinión actual en biotecnología 24 (2013) (4) págs. 737-744. DOI:10.1016/j.copbio.2013.03.013.
  25. ↑ 1 2 Ko, S.-K.; Chen, X.; Yoon, J.; Shin, I. El pez cebra como un buen modelo vertebrado para la obtención de imágenes moleculares mediante sondas fluorescentes // Chemical Society Reviews 40 (2011) (5) págs. 2120-2130. DOI:10.1039/c0cs00118j.
  26. ↑ Microscopía óptica de superresolución de Bo Huang: opciones múltiples // Opinión actual en biología química 14 (2010) (1) págs. 10-14. DOI:10.1016/j.cbpa.2009.10.013.
  27. ↑ Lothar Schermelleh, Rainer Heintzmann, Heinrich Leonhardt Una guía para la microscopía de fluorescencia de súper resolución // The Journal of Cell Biology 190 (2010) (2) P. 165. DOI:10.1083/jcb.201002018.
  28. ^ 1 2 Alexander P. Demchenko Espectroscopia ultravioleta de proteínas. - Springer, 1986. - ISBN 978-3-642-70849-7
  29. ↑ Crespo-Hernández, CE; Cohen, B.; Liebre, PM; Kohler, B. Dinámica de estado excitado ultrarrápido en ácidos nucleicos // Chemical Reviews 104 (2004) (4) págs. 1977-2020. DOI:10.1021/cr0206770.
  30. ↑ Waggoner, A. Etiquetas fluorescentes para proteómica y genómica // Opinión actual en biología química 10 (2006) (1) págs. 62-66. DOI:10.1016/j.cbpa.2006.01.005.
  31. ↑ Du, W.; Wang, Y.; Luo, Q.; Liu, B.-F. Imágenes moleculares ópticas para biología de sistemas: de la molécula al organismo // Química analítica y bioanalítica 386 (2006) (3) págs. 444-457. DOI:10.1007/s00216-006-0541-z.
  32. ↑ Lavis, LD Histoquímica: en vivo y en color // Revista de histoquímica y citoquímica 59 (2011) (2) págs. 139-145. DOI:10.1369/0022155410395760.
  33. ↑ Ueno, T.; Nagano, T. Sondas fluorescentes para detección e imagen // Nature Methods 8 (2011) pp. 642-645. DOI:10.1038/nmet.1663.
  34. ↑ 12 Lavis, L.D .; Raines, RT Ideas brillantes para biología química // ACS Chemical Biology 3 (2008) (3) págs. 142-155. DOI:10.1021/cb700248m.
  35. ↑ 1 2 Zheng, H.; Zhan, X.-Q.; Bian, Q.-N.; Zhang, X.-J. Avances en la modificación de fluoróforos de fluoresceína y rodamina como quimiosensores fluorescentes // Chemical Communications 49 (2012) pp. 429-447. DOI:10.1039/c2cc35997a.
  36. ↑ Beija, M.; Alfonso, CAM; Martinho, JMG Síntesis y aplicaciones de derivados de rodamina como sondas fluorescentes // Chemical Society Reviews 38 (2009) (8) pp. 2410-2433. DOI:10.1039/B901612K.
  37. ↑ Boens, N.; Len, V.; Dehaen, W. Indicadores fluorescentes basados ​​en BODIPY // Chemical Society Reviews 41 (2012) pp. 1130-1172.
  38. ↑ Tatikolov, AS Tintes de polimetina como sondas fluorescentes espectrales para biomacromoléculas // Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews 13 (2012) (1) pp. 55-90. DOI:10.1016/j.jphotochemrev.2011.11.001.
  39. ↑ Beverina, L.; Salice, P. Squaraine Compounds: diseño personalizado y síntesis hacia una variedad de aplicaciones de ciencia de materiales // European Journal of Organic Chemistry (2010) pp. 1207-1225. DOI:10.1002/ejoc.200901297.
  40. ↑ Chen, X.; Pradhan, T.; Wang, F.; Kim, JS; Yoon, J. Quimiosensores fluorescentes basados ​​en la apertura de xantenos y derivados relacionados // Chemical Reviews 112 (2012) pp. 1910-1956. DOI:10.1021/cr200201z.
  41. ↑ Yuan, L.; Lin, W.; Zheng, K.; El, L.; Huang, W. Sondas fluorescentes sensibles a analitos de rojo lejano a infrarrojo cercano basadas en plataformas de fluoróforos orgánicos para imágenes de fluorescencia // Chemical Society Reviews 42 (2013) pp. 622-661. DOI:10.1039/C2CS35313J.
  42. ↑ Grimm, JB; Heckman, LM; Lavis, LD; May, CM La química de las sondas fluorogénicas de molécula pequeña // Progreso en biología molecular y ciencia traslacional 113 (2013) pp. 1-13. DOI:10.1016/B978-0-12-386932-6.00001-6.
  43. ↑ Wysocki, LM; Lavis, L. D. Avances en la química de sondas fluorescentes de molécula pequeña // Opinión actual en biología química 15 (2011) (6) págs. 752-759. DOI:10.1016/j.cbpa.2011.10.013.
  44. ↑ Sun, Y.-Q.; Liu, J.; Lv, X.; Liu, Y.; Zhao, Y.; Guo, W. Tintes de rojo lejano a infrarrojo cercano inspirados en rodamina y su aplicación como sondas de fluorescencia // Angewandte Chemie International Edition 51 (2012) (31) págs. 7634-7636. DOI:10.1002/anie.201202264.
  45. ↑ Finney, NS Descubrimiento combinatorio de fluoróforos y sondas fluorescentes // Opinión actual en biología química 10 (2006) (3) págs. 238-245. DOI:10.1016/j.cbpa.2006.04.025.
  46. ↑ Bunzli, J.-C. Luminiscencia de lantánidos G para análisis biomédicos e imágenes // Chemical Reviews 110 págs. 2729-2755. DOI:10.1021/cr900362e.
  47. ↑ Shimomura O, Johnson F, Saiga Y (1962). "Extracción, purificación y propiedades de la aecuorina, una proteína bioluminiscente del hidromedusano luminoso, Aequorea". J Cell Comp Physiol 59(3): 223-39. doi:10.1002/jcp.1030590302.
  48. ↑ Ormö M, Cubitt A, Kallio K, Gross L, Tsien R, Remington S Estructura cristalina de la proteína fluorescente verde Aequorea victoria // Science 273 (1996) pp. 1392-1395. DOI:10.1126/ciencia.273.5280.1392.
  49. ↑ Yang F, Moss L, Phillips G La estructura molecular de la proteína verde fluorescente // Nature Biotechnology 14 (1996) (10) pp. 1246-1251. DOI:10.1038/nbt1096-1246.
  50. ↑ 1 2 Tsien, RY La proteína fluorescente verde // Revisión anual de bioquímica 67 (1998) (1) págs. 509-544. DOI:10.1146/annurev.biochem.67.1.509.
  51. ↑ Zimmer, M. Proteína fluorescente verde (GFP): aplicaciones, estructura y comportamiento fotofísico relacionado // Chemical Reviews 102 (2002) (3) págs. 759-782. DOI:10.1021/cr010142r.
  52. ↑ Beat Ludin, Andrew Matus GFP ilumina el citoesqueleto // Trends in Cell Biology 8 (1998) (2) pp. 72-77. DOI:10.1016/S0962-8924(98)80015-9.
  53. ↑ Tsien, RY Construyendo y reproduciendo moléculas para espiar células y tumores // FEBS Letters 579 (2005) (4) pp. 927-932. DOI:10.1016/j.febslet.2004.11.025.
  54. ↑ Giepmans, BNG, Adams, SR, Ellisman, MH y Tsien, RY (2006). La caja de herramientas fluorescente para evaluar la ubicación y función de proteínas. Ciencia, 312 (5771), 217-224.
  55. ↑ Stepanenko, OV; Stepanenko, OV; Shcherbakova, D. M.; Kuznetsova, IM; Turoverov, K. K.; Verkhusha, VV Proteínas fluorescentes modernas: desde la formación de cromóforos hasta nuevas aplicaciones intracelulares // BioTechniques 51 (2011) pp. 313-327. DOI:10.2144/000113765.
  56. ↑ Zhou, XX; Lin, MZ Proteínas fluorescentes fotoconmutables: diez años de química colorida y aplicaciones emocionantes // Opinión actual en biología química 17 (2013) (4) págs. 682-690. DOI:10.1016/j.cbpa.2013.05.031.
  57. ↑ Ohba, Y., Fujioka, Y., Nakada, S., Tsuda, M. y May, CM Biosensores basados ​​en proteínas fluorescentes y sus aplicaciones clínicas. // Progreso en Biología Molecular y Ciencia Traslacional 113 (2013) pp. 313-348. DOI:10.1016/B978-0-12-386932-6.00008-9.
  58. ↑ VanEngelenburg, SB; Palmer, AE, Fluorescent biosensors of protein function // Current Opinion in Chemical Biology 12 (2008) pp. 60-65. DOI:10.1016/j.cbpa.2008.01.020.
  59. ↑ Tiwari, DK; Nagai, T. Proteínas fluorescentes inteligentes: innovación para imágenes de superresolución sin barreras en células vivas, Desarrollo, crecimiento y diferenciación 55 (2013) (4) págs. 491-507. DOI:10.1111/dgd.12064.
  60. ↑ El Premio Nobel de Química 2008 . Consultado el 14 de diciembre de 2013. Archivado desde el original el 15 de octubre de 2015.
  61. ↑ Jyoti K. Jaiswal, Sanford M. Simon Potenciales y peligros de los puntos cuánticos fluorescentes para imágenes biológicas // Tendencias en biología celular 14 (2004) (9) págs. 497-504. DOI:10.1016/j.tcb.2004.07.012.
  62. ↑ Biju, V., Itoh, T. e Ishikawa, M. (2010). Entrega de puntos cuánticos a las células: puntos cuánticos bioconjugados para imágenes extracelulares e intracelulares dirigidas e inespecíficas. Revisiones de la Sociedad Química, 39(8), 3031-3056.
  63. ↑ Jin, Z. y Hildebrandt, N. (2012). Puntos cuánticos de semiconductores para diagnóstico in vitro e imágenes celulares. Tendencias en Biotecnología.
  64. ↑ Vivero-Escoto, JL, Huxford-Phillips, RC y Lin, W. Nanosondas basadas en sílice para imágenes biomédicas y aplicaciones teranósticas. // Química. soc. Rvdo. 41 (2012) págs. 2673-2685. DOI:10.1039/c2cs15229k.
  65. ↑ Wu, C.; Chiu, D.T. Puntos de polímero semiconductor altamente fluorescentes para biología y medicina // Angewandte Chemie International Edition 52 (2013) págs. 3086-3109. DOI:10.1002/anie.201205133.
  66. ↑ Han, B. y Wang, E. Nanoclusters de plata fluorescente con plantilla de ADN // Química analítica y bioanalítica 402 (2012) (1) págs. 129-138. DOI:10.1007/s00216-011-5307-6.
  67. ↑ Shiang, Y.-C.; Huang, CC-C.; Chen, W.-Y.; Chen, PC-C.; Chang, H.-T. Nanoclusters fluorescentes de oro y plata para el análisis de biopolímeros e imágenes celulares // Journal of Materials Chemistry 22 (2012) pp. 12972-12982. DOI:10.1039/c2jm30563a.
  68. ↑ Lemke, EA; Schultz, C. Principios para el diseño de sensores y reporteros fluorescentes // Nature Chemical Biology 7 (2011) pp. 480-483. DOI:10.1038/nchembio.620.
  69. ↑ JC Simpson, B. Joggerst, V. Laketa, F. Verissimo, C. Cetin, H. Erfle, MG Bexiga, VR Singan, J.-K. Hériché, B. Neumann, A. Mateos, J. Blake, S. Bechtel, V. Benes, S. Wiemann, J. Ellenberg, R. Pepperkok La detección de ARNi en todo el genoma identifica proteínas humanas con una función reguladora en la vía secretora temprana // Nature Cell Biology 14 (2012) págs. 764-774. DOI:10.1038/ncb2510.
  70. ↑ Susan M. Gasser Visualización de la dinámica de cromatina en núcleos de interfase // Science 2002 (2002) (296) págs. 1412-1416. DOI:10.1126/ciencia.1067703.
  71. ↑ Nathalie Daigle, Jan Ellenberg λN-GFP: un sistema informador de ARN para imágenes de células vivas // NATURE METHODS 4 (2007) (8) págs. 633-636. DOI:10.1038/NMETH1065.
  72. ↑ Johnson, I. Sondas fluorescentes para células vivas // The Histochemical Journal 30 (1998) (3) págs. 123-140. DOI:10.1023/a:1003287101868.
  73. ↑ Shi, W.; Ma, H. Spectroscopic probes with changeable π-conjugated systems, Chemical Communications 48 (2012) pp. 8732-8744. DOI:10.1039/c2cc33366j.
  74. ↑ Liu, Z.; Labrar.; Guo, Z. Coordinación de metales en la detección fotoluminiscente // Chemical Society Reviews 42 (2013) (4) pp. 1568-1600. DOI:10.1039/c2cs35363f.
  75. ↑ de Silva, AP, Gunaratne, HQN, Gunnlaugsson, T., Huxley, AJM, McCoy, CP, Rademacher, JT y Rice, TE Señalización de eventos de reconocimiento con sensores e interruptores fluorescentes // Chemical Reviews 97 (1997) (5) S. 1515-1566. DOI:10.1021/cr960386p.
  76. ↑ Chan, J.; Dodani, Carolina del Sur; Chang, CJ Sondas fluorescentes de moléculas pequeñas basadas en reacciones para la obtención de imágenes biológicas quimioselectivas // Nature Chemistry 4 (2012) págs. 973-984. DOI:10.1038/NCHEM.1500.
  77. ↑ Grynkiewicz, G.; Poenie, M.; Tsien, RY Una nueva generación de indicadores de Ca2+ con propiedades de fluorescencia muy mejoradas. Archivado el 1 de enero de 2015 en Wayback Machine // Journal of Biological Chemistry 260 (1985) págs. 3440-3450 .
  78. ↑ Demchenko, AP; Mely, Y.; Duportail, G.; Klymchenko, AS Monitoreo de las propiedades biofísicas de las membranas lipídicas mediante sondas fluorescentes sensibles al medio ambiente // Biophysical Journal 96 (2009) (9) págs. 3461-3470. DOI:10.1016/j.bpj.2009.02.012.
  79. ↑ Haidekker, MA; Theodorakis, EA Rotores moleculares: biosensores fluorescentes para viscosidad y flujo // Química orgánica y biomolecular 5 (2007) págs. 1669-1678. DOI:10.1039/b618415d.
  80. ↑ Kuimova, MK Mapeo de la viscosidad en células usando rotores moleculares // Física Química Química Física 14 (2012) pp. 12671-12686. DOI:10.1039/c2cp41674c.
  81. ↑ Johnson, N.; Johnsson, K. Herramientas químicas para imágenes biomoleculares // ACS Chemical Biology 2 (2007) (1) págs. 31-38. DOI:10.1021/cb6003977.
  82. ↑ Terai, T.; Nagano, T. Sondas fluorescentes para aplicaciones de bioimagen // Opinión actual en biología química 12 (2008) (515-521). DOI:10.1016/j.cbpa.2008.08.007.
  83. ↑ Franca, LTC, Carrilho, E. y Kist, TBL Una revisión de las técnicas de secuenciación de ADN // Quarterly Reviews of Biophysics 35 (2002) (02) pp. 169-200. DOI:10.1017/S0033583502003797.
  84. ↑ Maxam, AM; Gilbert, W. Un nuevo método para secuenciar el ADN Archivado el 25 de abril de 2015 en Wayback Machine // Actas de la Academia Nacional de Ciencias 74 (1977) (2) págs. 560-564.
  85. ↑ Sanger, F.; níquel, S.; Coulson, AR Secuenciación de ADN con inhibidores de terminación de cadena // Actas de la Academia Nacional de Ciencias 74 (1977) (12) págs. 5463-5467.
  86. ↑ Ju, J.; Kim, DH; Bi, L.; Meng, Q.; Bai, X.; Li, Z.; Li, X.; Marma, MS; Shi, S.; Wu, J.; Edwards, JR; Romu, A.; Turro, NJ Secuenciación de ADN de cuatro colores por síntesis usando terminadores reversibles de nucleótidos fluorescentes escindibles // Actas de la Academia Nacional de Ciencias 103 (2006) (52) pp. 19635-19640. DOI:10.1073/pnas.0609513103.
  87. ↑ 1 2 Tyagi, S.; Kramer, FR Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization // Nature Biotechnology 14(3) pp. 303-308. DOI:10.1038/nbt0396-303.
  88. ↑ Guo, J.; Ju, J.; Turro, N., Sondas de hibridación fluorescentes para la detección de ácidos nucleicos. // Química Analítica y Bioanalítica 402 (2011) (10) pp. 3115-3125. DOI:10.1007/s00216-011-5526-x.
  89. ↑ Didenko, VV DNA Probes Using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET): Designs and Applications Archivado el 7 de octubre de 2013 en Wayback Machine (pdf) // BioTechniques 31 (2001) pp. 1106-1121 .
  90. ↑ Juskowiak, B. Sondas fluorescentes basadas en ácido nucleico y su potencial analítico // Química analítica y bioanalítica 399 (9) págs. 3157-3176. DOI:10.1007/s00216-010-4304-5.
  91. ↑ Tyagi S, Bratu DP, Kramer FR Balizas moleculares multicolores para la discriminación de alelos // Nature Biotechnology 16 (1998) págs. 49-53 DOI: 10.1038/nbt0198-49.
  92. ↑ Ranasinghe, RT; Brown, T. Estrategias basadas en fluorescencia para el análisis genético // Chemical Communications (2005) pp. 5487-5502. DOI:10.1039/b509522k.
  93. ↑ Silverman, AP; Kool, ET Sondas apagadas para la detección altamente específica de ARN celular // Trends in Biotechnology 23 (2005) (5) pp. 225-230. DOI:10.1016/j.tibtech.2005.03.007.
  94. ↑ Tyagi, S. Imaging intracelular RNA distribución y dinámica en células vivas // Nature Methods 6 (2009) (5) pp. 331-338. DOI:10.1038/nmet.1321.
  95. ↑ Wang, K.; Huang, J.; Yang, X.; él, X.; Liu, J. Avances recientes en sondas de ácido nucleico fluorescente para estudios de células vivas // Analyst 138 (2013) pp. 62-71. DOI:10.1039/c2an35254k.
  96. ↑ 1 2 Sassolas, A.; Leca-Bouvier, BD; Blum, LJ DNA Biosensors and Microarrays // Chemical Reviews 108 (2008) págs. 109-139. DOI:10.1021/cr0684467.
  97. ↑ Pirrung, MC Bibliotecas combinatorias direccionables espacialmente // Chemical Reviews 97 (1997) (2) págs. 473-488. DOI:10.1021/cr960013o.
  98. ↑ Kapuscinski, J. DAPI: una sonda fluorescente específica de ADN // Biotécnica e histoquímica 70 (1995) (5) págs. 220-233. DOI:10.3109/10520299509108199.
  99. ↑ Yarmoluk, SM; Kovalska, V. B.; Losytskyy, MY Tintes de cianina simétricos para detectar ácidos nucleicos // Biotechnic & Histochemistry 83 (2008) pp. 131-145. DOI:10.1080/10520290802383684.
  100. ↑ Vummidi, BR; Alzeer, J.; Luedtke, NW Fluorescent Probes for G-Quadruplex Structures // ChemBioChem 14 (2013) (5) págs. 540-558. DOI:10.1002/cbic.201200612.
  101. ↑ Neto, MALO; Correa, JR; Silva, RG, Tinción mitocondrial selectiva con sondas fluorescentes pequeñas: importancia, diseño, síntesis, desafíos y tendencias para nuevos marcadores. // Avances RSC 3 (2013) págs. 5291-5301. DOI:10.1039/c2ra21995f.
  102. ↑ Wahlfors, J.; Loimas, S.; Pasanen, T.; Hakkarainen, T. Construcciones de fusión de proteína fluorescente verde (GFP) en la investigación de terapia génica // Histoquímica y biología celular 115 (2001) pp. 59-65. DOI:10.1007/s004180000219.
  103. ↑ Zhang, J.; Campbell, RE; Ting, AY; Tsien, RY Creación de nuevas sondas fluorescentes para biología celular // Nature Reviews Molecular Cell Biology 3 (2002) (12) págs. 906-918. DOI:10.1038/nrm976.
  104. ↑ Ivan Gushchin, Valentin Gordeliy, Ulrich Krauss, Karl-Erich Jaeger, Mehdi D. Davari. Una proteína fluorescente basada en flavina termoestable de Chloroflexus aggregans: un marco para estudios estructurales de ultra alta resolución  //  Ciencias fotoquímicas y fotobiológicas. — 2019-05-01. — ISSN 1474-9092 . -doi : 10.1039/ C9PP00067D . Archivado el 25 de mayo de 2019.
  105. ↑ 12 Lichtman , JW; Conchello, J.-A. Microscopía de fluorescencia // Nature Methods 2 (2005) (12) pp. 910-919. DOI:10.1038/nmeth817.
  106. ↑ Bo Huang, Hazen Babcock, Xiaowei Zhuang Rompiendo la barrera de la difracción: Imágenes de superresolución de las células // Cell 143 (2010) págs. 1047-1058. DOI:10.1016/j.cell.2010.12.002.
  107. ↑ Hell, SW Nanoscopia óptica de campo lejano // Science 316 (2007) págs. 1153-1158. DOI:10.1126/ciencia.1137395.

Literatura

Enlaces