Cas9

Cas9 ( C RISPR associated  protein 9 , proteína asociada a CRISPR) es una endonucleasa guiada por ARN asociada con el sistema inmunitario adaptativo CRISPR ( repeticiones palindrómicas agrupadas regularmente interespaciadas ) en varias bacterias, en particular Streptococcus pyogenes . S. pyogenes utiliza Cas9 para almacenar [1] , luego comprobar y cortar ADN extraño [2] , como ADN de bacteriófagos o plásmidos .  

Cas9 realiza la verificación desenrollando el ADN extraño y determinando su complementariedad con el espaciador emparejado de veinte bases del ARN de control . Si el sustrato es complementario al ARN guía, Cas9 escinde el ADN extraño. En este sentido, el mecanismo CRISPR-Cas9 tiene una serie de paralelismos con el mecanismo de interferencia de ARN (ARNi) en eucariotas. La seguridad de la aplicación práctica de este método está determinada, entre otras cosas, por el hecho de que la secuencia deseada de veinte pares de bases sea única en el ADN modificado.

Uso de Cas9 en ingeniería genética

Además de su función original en la inmunidad bacteriana, la proteína Cas9 se usa activamente para crear puntos de ruptura en la doble hélice del ADN, tales rupturas pueden conducir a la inactivación de genes o a la creación de genes heterólogos a través de la conexión de extremos no homólogos y la correspondiente recombinación homóloga. . Junto con las proteínas ZFN y TALEN , Cas9 se convierte en una importante herramienta de edición del genoma. [3]

Uno de los primeros en demostrar la división programada del ADN por la proteína Cas9 fue el bioquímico lituano Virginijus Šikšnis , pero Cell Reports no aceptó su artículo para su consideración el 18 de abril de 2012. Un mes después, lo envió a PNAS , donde tomó varios meses revisarlo y publicarlo [4] . Mientras tanto, la bioquímica estadounidense Jennifer Dowdna y el microbiólogo francés Emmanuel Charpentier publicaron su artículo en la revista científica revisada por pares Science , donde fue revisado y aceptado en dos semanas [4] .

Emmanuelle Charpentier y Jennifer Dowdna recibieron el Premio Nobel de Química 2020 por crear nuevas tecnologías que permiten que CRISPR-Cas9 edite el genoma . [5]

Es sorprendente que, debido a restricciones de patentes, la tecnología de edición Cas9 no esté disponible para científicos de todo el mundo, sino solo para los titulares de patentes, lo que es un obstáculo para el progreso de la ciencia, el desarrollo de medicamentos para personas que viven con enfermedades graves [6] .

Para 2012, Cas9 ganó popularidad porque puede escindir casi cualquier secuencia de nucleótidos que sea complementaria a un ARN de control [2] . Dado que la selectividad de Cas9 es consecuencia de la complementariedad del ARN y el ADN de control, y no de la modificación de la proteína en sí (a diferencia de los casos de TALEN y ZFN), es posible la producción de Cas9 específicos para nuevas dianas de ADN [7]. ] . Las variantes de Cas9 que se unen al ADN pero no lo escinden (dCas9) se pueden utilizar para administrar activadores o represores transcripcionales a secuencias de ADN específicas para regular la activación y represión transcripcional [8] [9] . Aunque Cas9 nativo requiere que un ARN guía esté compuesto por dos ARN fundamentalmente diferentes, ARN CRISPR (ARNcr) y ARN de transactivación (ARNtracr) [2] , el direccionamiento de Cas9 se ha simplificado mediante la producción de un único ARN guía quimérico. Se supone que Cas9 se puede utilizar para cambiar el genoma de poblaciones enteras de organismos [10] . En 2015, el genoma del embrión humano se modificó por primera vez utilizando Cas9 [11] . Se ha desarrollado la tecnología de ingeniería inmunogenómica de hibridomas , que permite reprogramar rápidamente la especificidad de sus anticuerpos utilizando Cas9 [12] .

Se ha creado una tecnología que permite editar “letras” individuales de ADN y ARN sin cortar la cadena de ADN, sino convirtiendo una base de nucleótidos en otra [13] , lo que permitirá tratar enfermedades congénitas causadas por mutaciones puntuales . [14] [15] [16]

Usando citidina - desaminasas o adenosina - desaminasas conectadas a dCas9, puede desactivar la expresión (introduciendo codones de parada prematuros [17] ) o cambiar el empalme necesario para la síntesis de ciertas proteínas [18] [19]

Se ha creado la tecnología MAGESTIC (edición precisa del genoma multiplexada con códigos de barras celulares cortos, rastreables e integrados), que no solo escinde el ADN, sino que también entrega una pieza de ADN necesaria para el reemplazo preciso en el sitio de ruptura (usando la proteína híbrida de unión al ADN LexA -Fkh1p), que mejora la precisión y la eficiencia de la edición [20] [21] . La transposasa asociada a CRISPR CAST (transposasa asociada a CRISPR) de la cianobacteria Scytonema hofmanni puede ser otra herramienta para la inserción de ADN dirigida . ShCAST cataliza la transposición de ADN impulsada por ARN mediante la inserción unidireccional de segmentos de ADN de 60 a 66 pb corriente abajo del protoespaciador [22] .

Usando dCas9

Al combinar la molécula dCas9 inactivada, que se une al ADN pero no lo escinde, con la nucleasa FokI , es posible obtener nucleasas y enzimas de restricción para el corte de ADN altamente selectivo [23] [24] [25] . También se ha desarrollado un método para la reprogramación epigenética selectiva de la actividad génica utilizando una molécula dCas9 inactivada acoplada a una enzima que realiza la desmetilación del ADN [26] . Además, dicha reprogramación del epigenoma puede llevarse a cabo incluso in vivo [27] [28] . Más tarde, resultó que si el ARN de control se acorta a 14 o 15 nucleótidos, la molécula Cas9 pierde su capacidad para cortar el ADN [29] [30] . Utilizando esta propiedad, fue posible crear un sistema para la activación selectiva de ciertos genes in vivo y probar su eficacia mediante el tratamiento de ratones con enfermedades modeladas [31] . Este método tiene un solo problema: normalmente, el sistema CRISPR se carga en un virus inofensivo llamado virus adenoasociado (AAV) , que lleva el sistema al interior de la célula. Pero toda la proteína, que consta de dCas9 y ARN guía, es demasiado grande para caber en un solo AAV. Para sortear este problema, los investigadores cargaron dCas9 en un virus y el ARN de control en otro [31] . Se crearon líneas de ratones transgénicos para la regulación génica dirigida in vivo mediante la edición del epigenoma utilizando los sistemas dCas9p300 y dCas9KRAB. Estas cepas de ratón son herramientas útiles para manipular la expresión génica in vivo con varios ARN guía. [32]

Para aumentar la eficiencia de la molécula dCas9, una serie polipeptídica repetitiva de antígenos repetitivos , llamada SunTag, puede atraer múltiples copias de anticuerpos asociados con una enzima de edición epigenética o con un marcador fluorescente . [34] [33]

Otra aplicación de dCas9 es la modificación programada de aminoácidos en proteínas de la cromatina . Por ejemplo, la histona - proteína quinasa artificial dCas9-dMSK1 permite la hiperfosforilación de la serina 28 en la histona H3 (H3S28ph), que desempeña el papel de "botón de inicio" en la activación selectiva de promotores y, por lo tanto, aumenta la expresión de genes seleccionados . [35] [36]

Nuevas formas de enviar Cas9 a la celda

Los requisitos principales para el sistema de administración de Cas9, además de una alta eficiencia de administración, son: (1) la construcción que sintetiza Cas9 no debe integrarse en el genoma celular y no debe estar permanentemente en la célula para no interferir con la célula y no provocar respuestas inmunitarias; (2) el vehículo de administración debe ser capaz de albergar una enzima Cas9 suficientemente grande o un ARNm que lo codifique, así como uno o más ARN guía; (3) debe ser conveniente para uso inyectable; (4) dicha herramienta, junto con Cas9 y los ARN guía, debería ser lo suficientemente fácil de reproducir para la producción a gran escala de un fármaco para combatir enfermedades comunes. A diferencia de los sistemas de administración viral, las nanopartículas lipídicas cumplen estos criterios. [37] [38] Por ejemplo, se creó un sistema de administración Cas9 biodegradable con una nanopartícula lipídica, que permitió lograr in vivo más del 97 % de inhibición del nivel de una de las proteínas del suero sanguíneo después de una sola inyección. Además, tal administración única, a pesar de la naturaleza temporal del sistema de entrega y los componentes del sistema de edición, condujo a una inhibición a largo plazo que duró 12 meses [39] . Las vesículas extracelulares también se utilizan para el suministro [40]

Sin embargo, continúa el desarrollo de partículas virales para la entrega de Cas9 y sgRNA . Uno de estos desarrollos es NanoMEDIC (vesículas extracelulares derivadas de nanomembranas para la entrega de carga macromolecular) [41] NanoMEDIC ha inducido de manera efectiva la edición del genoma en varios tipos de células humanas, como células T, monocitos, iPSC y células miogénicas.

Las proteínas Cas más compactas son más fáciles de transportar a las células para la edición del genoma porque se pueden empaquetar en vehículos de entrega más pequeños, como el virus adenoasociado (AAV) desactivado. Como tales proteínas compactas, se pueden utilizar las variantes de Cas que se encuentran en los bacteriófagos , por ejemplo, CRISPR-CasΦ, que tiene la mitad del peso molecular en comparación con Cas9 [42] o el CasMINI modificado genéticamente, que, a pesar de su pequeño tamaño, resultó ser tan efectivo en células de mamíferos como el Cas ordinario, y al mismo tiempo penetra mejor en las células [43]

Modificación Cas9

La modificación de Cas9 por su fusión con péptidos moduladores de la cromatina derivados de las proteínas de alta movilidad HMGN1 y HMGB1 , la histona H1 y los complejos de remodelación de la cromatina aumenta varias veces su actividad, especialmente en relación con las regiones refractarias de la cromatina. Esta estrategia de fusión, denominada CRISPR-chrom, se puede utilizar para mejorar la eficacia de las nucleasas Cas9 en la modificación del genoma [44] .

Edición de cartilla CRISPR/Cas9

Edición de cebadores dCas9-RT : este método utiliza la nucleasa Cas9 (modificada para que pueda crear una ruptura en solo una hebra de ADN) acoplada a una transcriptasa inversa (RT) y en lugar del ARN guía habitual, el llamado pegRNA ( guid de edición principal) se utiliza RNA - conguía de edición de primer RNA). Este método, según los autores, es más preciso y versátil que todas las alternativas CRISPR desarrolladas hasta el momento [45] [47] [48] [46] .

Uso de dCas9 para visualizar secuencias genómicas in situ

Los investigadores han desarrollado una nueva técnica de imagen molecular utilizando la endonucleasa dirigida por ARN CRISPR/dCas9 unida a una etiqueta. La tecnología hizo posible marcar secuencias genómicas seleccionadas en núcleos y cromosomas in situ. El método se llama RGEN-ISL. A diferencia de la hibridación in situ fluorescente clásica , RGEN-ISL no requiere la desnaturalización del ADN y, por lo tanto, proporciona una mejor conservación de la estructura de la cromatina [49] . Una herramienta genética llamada CRISPR-HOT (transgénesis de organoide independiente de homología mediada por CRISPR-Cas9) realiza una función similar para marcar con color ciertos genes en orgánulos humanos [50] [51] [52] .

Véase también

Enlaces

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