Interferencia de ARN

La interferencia de ARN ( ing.  interferencia de ARN, RNAi ) es el proceso de supresión de la expresión génica en la etapa de transcripción , traducción , deadenilación o degradación del ARNm utilizando moléculas pequeñas de ARN.

Se han encontrado procesos de interferencia de ARN en las células de muchos eucariotas : en animales , plantas y hongos . El sistema de interferencia de ARN juega un papel importante en la protección de las células contra los virus , los genes parásitos  ( transposones ) y en la regulación del desarrollo , la diferenciación y la expresión de los genes de un organismo .

El proceso de interferencia del ARN comienza con la acción de la enzima Dicer , que corta moléculas largas de ARN de doble cadena (dsRNA) en fragmentos cortos del orden de 21 a 25 nucleótidos llamados siRNA . Una de las dos cadenas de cada fragmento se denomina "guía", este ARN monocatenario se incluye además en el complejo ARN-proteína RISC . Como resultado de la actividad de RISC, un fragmento de ARN monocatenario se une a una secuencia complementaria de la molécula de ARNm y hace que la proteína Argonaute corte el ARNm o inhiba la traducción y/o la deadenilación del ARNm. Estos eventos conducen a la supresión de la expresión (silenciamiento) del gen correspondiente, cuya eficacia está limitada por las concentraciones de pequeñas moléculas de ARN: siARN y microARN .

El efecto selectivo de la interferencia del ARN en la expresión génica hace que la iARN sea una herramienta útil para los estudios que utilizan cultivos celulares y organismos vivos, ya que los ARN sintéticos de doble cadena introducidos en las células provocan la supresión de genes específicos. RNAi se utiliza para la investigación a gran escala en biología molecular , bioquímica , biotecnología y medicina . Por ejemplo, la interferencia de ARN se utiliza para "desactivar" sistemáticamente los genes en las células y establecer las funciones de los genes en el estudio de la división celular .

Históricamente, la interferencia de ARN se ha conocido como silenciamiento génico postranscripcional . No fue hasta que se investigaron estos procesos supuestamente no relacionados que quedó claro que todos describían manifestaciones de RNAi. En 2006, los científicos estadounidenses Andrew Fire y Craig Mello recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por su trabajo sobre el estudio de la interferencia de ARN en el nematodo Caenorhabditis elegans [1] , publicado en 1998 [2] .

Historia

Antes del descubrimiento de la interferencia de ARN en plantas, se describió la inhibición de la transcripción por ARN antisentido [4] . En 1990, para cambiar el color de las flores de petunia ( Petunia hybrida ), se introdujeron en las plantas copias adicionales del gen de la chalcona sintasa, una enzima necesaria para la síntesis de pigmentos rosados ​​y morados. Sin embargo, el aumento de la expresión del gen de la sintasa no resultó en un color más oscuro del perianto , por el contrario, las flores se volvieron más claras e incluso parcialmente blancas. Los resultados obtenidos indicaron que la actividad de la enzima no aumentó, sino que disminuyó. Los genes de la chalcona sintasa se expresaron a un nivel más bajo que antes de la introducción del transgén . [5] [6] Algún tiempo después, se describió el "silenciamiento de genes" en el hongo Neurospora crassa , pero este proceso no se ha correlacionado con los procesos descritos para las plantas [7] . Otros estudios han demostrado que la degradación del ARNm en las plantas conduce a una disminución de la actividad génica a través del mecanismo de inhibición postranscripcional [8] . Este fenómeno se denominó "cosupresión de la expresión génica", sin embargo, el mecanismo de este proceso no se conocía [9] .

Se ha descrito un efecto inesperado similar en un intento de aumentar la resistencia de las plantas a los virus . Se sabía que las plantas que expresan proteínas virales tienen una mayor resistencia a la infección viral, pero estudios posteriores han demostrado que la resistencia a la infección por otros virus solo la proporcionan tramos cortos de ARN viral no codificante. Los investigadores también creían que los ARN virales transgénicos también podían inhibir la replicación viral [10] . Un experimento inverso, en el que se introdujeron secuencias cortas de genes de plantas en el genoma del virus , mostró que los genes objetivo se suprimieron en las plantas infectadas. Este fenómeno se ha denominado " silenciamiento génico inducido por virus , VIGS " , y la combinación de tales fenómenos se ha denominado silenciamiento génico postranscripcional ( ing  . silenciamiento génico postranscripcional ) [11] .  

Después de las observaciones realizadas en las plantas, muchos laboratorios de todo el mundo han tratado de detectar un fenómeno similar en otros organismos [12] [13] . Craig Mello y Andrew Fire , en un artículo de Nature de 1998 , describieron el efecto del silenciamiento génico después de que se introdujera ARN de doble cadena en el cuerpo del gusano redondo Caenorhabditis elegans [2] . En estudios sobre la regulación de la síntesis de proteínas musculares, Mello y Fire demostraron que la administración de ARNm o ARN antisentido no afectó la síntesis de proteínas , mientras que la administración de ARN de doble cadena redujo con éxito la expresión del gen objetivo. El resultado de estos trabajos fue la aparición del término ARN de interferencia . Los estudios de Fire y Mello son dignos de mención porque en el transcurso de su trabajo se reveló el principio activo del sistema de silenciamiento génico postranscripcional. En 2006, Fire y Mello recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por su investigación en el campo de la interferencia de ARN [1] .

Componentes

El componente ribonucleico del sistema de interferencia de ARN puede estar representado por oligonucleótidos de doble cadena cortos endógenos y exógenos de dos tipos: microARN y ARN de interferencia pequeño ( siARN ) . 

Pequeños ARN de interferencia

Los ARN de interferencia pequeños son ARN de doble cadena de 21 a 25 nucleótidos de largo con dos nucleótidos colgantes no apareados en los extremos 3'. Cada cadena de nucleótidos tiene un grupo fosfato en el extremo 5' y un grupo hidroxilo en el extremo 3'. Esta estructura de siRNA está formada por la actividad de la enzima Dicer , cuyo sustrato son los RNA largos de doble cadena o los RNA cortos que contienen horquillas . [14] Los dúplex de pequeños ARN de interferencia entran luego en el complejo catalítico RISC , donde, con la participación de la proteína Argonaute, el dúplex se desenrosca y se forma un complejo complementario de ARN antisentido corto con una secuencia específica en la región codificante del ARNm, lo que conduce a una mayor degradación de este último. A diferencia de los miARN, los ARN de interferencia pequeños, por regla general, se emparejan con precisión con el objetivo y conducen a la escisión endonucleolítica de un único ARNm específico [15].

microARN

Los microARN ( ing.  MicroRNA, miRNA ) son ARN no codificantes de 21-22 nucleótidos de longitud, implicados en la regulación de la expresión génica . Los microARN se unen a secuencias de ARNm específicas en la región 3' no traducida y provocan la inhibición de la traducción o la eliminación de la cola poli(A) . Las moléculas de microARN se expresan como transcripciones primarias de genes largos que codifican precursores de microARN ( pri  -miARN, miARN primordial ) y, después del procesamiento en el núcleo celular , son estructuras de bucle de tallo pre-miARN de aproximadamente 70 nucleótidos de largo . El complejo de procesamiento de pri-miARN a pre-miARN contiene una enzima RNasa III llamada Drosha y una proteína Pasha de unión a ARN de doble cadena . La parte de doble cadena del pre-miARN se une y es cortada por la proteína Dicer (en Drosophila melanogaster , los miARN y los pequeños ARN de interferencia son procesados ​​por diferentes isoformas de la enzima Dicer [16] ); en este caso, se forma una molécula de microARN maduro, que luego puede entrar en RISC [17] [18] [19] . También existe una vía para la formación de miARN independiente de Dicer. El procesamiento del precursor de microARN en este caso lo lleva a cabo la proteína Argonaute 2 [20] [21] .

En los animales, los miARN normalmente no coinciden con el ARNm objetivo y pueden inhibir la traducción de muchos ARNm con secuencias similares. En las plantas, el apareamiento en muchos casos puede ser completo.

RISC

La parte catalítica de los RISC ( complejos silenciadores inducidos por ARN ) son proteínas endonucleasas de la familia Argonaute , que cortan el ARNm complementario al pequeño ARN de interferencia asociado [1] . Dado que los fragmentos que se forman después del corte con la proteína Dicer son de doble cadena, potencialmente cada una de las cadenas puede ser un pequeño ARN de interferencia ( ing. siRNA ). Sin embargo, solo una de las dos hebras, llamada hebra guía , se une a la proteína Argonaute y reprime la expresión génica . Otro hilo, llamado hilo pasajero , hilo anti-guía , sufre degradación durante la activación de RISC [22] . Aunque anteriormente se creía que las cadenas son separadas por una helicasa dependiente de ATP [23] , ahora se ha demostrado que este proceso es independiente de ATP y lo llevan a cabo directamente las proteínas que forman el RISC [24] [25 ] . La elección de la hebra guía es independiente de la dirección en la que Dicer corta el ARN de doble hebra antes de entrar en el RISC [26] [27] . La proteína R2D2 puede ser un factor que distingue el extremo 5' más estable de la cadena acompañante durante la unión [28] .     

La unión de moléculas de ARN al dominio de unión a ARN de una proteína de la familia Argonaute se estudió mediante análisis de difracción de rayos X. En este caso, el extremo 5' fosforilado del ARN monocatenario ingresa al bolsillo conservador de la proteína, donde el fosfato del extremo 5' es retenido por enlaces de coordinación con la participación del ion Mg 2+ y el residuo de adenina . entra en interacciones de apilamiento con el residuo de tirosina conservativo . Esta región de la proteína, aparentemente, estimula la unión de pequeños ARN de interferencia al ARNm diana [29] .

Hasta la fecha, no se comprende bien el mecanismo por el cual RISC encuentra ARNm complementario dentro de la célula. Se ha demostrado que la traducción no es necesaria para la degradación exitosa del ARNm por el complejo siRISC [30] . Además, se ha demostrado que la vía de interferencia del ARN puede ser más eficaz contra los ARNm diana que actualmente no están traducidos [31] . Las proteínas de la familia Argonaute son el componente catalítico de RISC y se encuentran en regiones específicas del citoplasma conocidas como cuerpos P [ 32 ] ; Se ha demostrado que la actividad de los pequeños ARN de interferencia y la degradación del ARNm son máximas precisamente en los cuerpos P [33] . Los cuerpos P son una parte importante del sistema de interferencia de ARN. Su destrucción conduce a una disminución en la eficiencia de este proceso. [34] .  

Mecanismo

La interferencia de ARN es un proceso de silenciamiento de genes dependiente de ARN que está controlado por RISC. RISC se activa en el citoplasma celular , donde las moléculas cortas de ARN de doble cadena interactúan con el componente catalítico de RISC, la proteína Argonaute [1] . En el caso de que el ARN de doble cadena sea exógeno (aparece como resultado de manipulaciones de laboratorio o infección con un virus que contiene ARN), el ARN está directamente en el citoplasma, donde es cortado en fragmentos cortos (siARN) por la proteína Dicer . , y el complejo funcional que contiene siRNA resultante se llama siRISC. En el caso de los pre- miARN expresados ​​a partir de genes de ARN no codificantes , la iARN se desencadena por el ARN de doble cadena endógeno. Las transcripciones primarias de dichos genes se procesan primero en el núcleo para formar pre - miRNA que contienen estructuras de bucle de tallo específicas. Luego, los pre - miARN se exportan al citoplasma y la proteína Dicer los escinde para formar miARN, que se incorporan a un complejo que contiene microARN llamado miRISC. Por lo tanto, RISC es el sitio donde se cruzan dos rutas de interferencia de ARN inducidas por ARN de doble cadena exógeno y endógeno [36] .

Corte de ARN de doble cadena

El ARN exógeno de doble cadena activa el sistema de interferencia del ARN al activar la enzima ribonucleasa Dicer [14] , que se une y corta los dúplex de ARN, lo que resulta en la formación de fragmentos de siARN de doble cadena de 21 a 25 pb de largo, con varias bases desapareadas en cada extremo. [38] [39] [40] [41] . El análisis bioinformático de los genomas de muchos organismos sugiere que tal longitud de siRNA aumenta su especificidad por el gen diana y reduce la probabilidad de unión no específica [42] . Además, los siRNA se dividen en cadenas separadas y están involucrados en RISC (siRISC). Una vez integrados en RISC, los siRNA se unen de forma complementaria al mRNA objetivo y provocan que el mRNA se corte , impidiendo así su traducción [43] .

El ARN bicatenario exógeno es reconocido y unido por proteínas efectoras especiales (por ejemplo, RDE-4 en Caenorhabditis elegans y R2D2 en Drosophila ) que aumentan la actividad de la proteína Dicer [44] . Estas proteínas efectoras se unen sólo a los ARN largos de doble cadena, pero se desconoce el mecanismo de afinidad por dichos sustratos [44] . Estas proteínas de unión a ARN facilitan la transferencia de ARNsi cortados al complejo RISC [45] .

En Caenorhabditis elegans , la vía de iniciación de la interferencia del ARN en la célula se puede mejorar como resultado de la síntesis de ARNsi "secundarios" en la plantilla de ARN de interferencia pequeños "primarios" [46] . Los siRNA “secundarios” difieren en estructura de los formados como resultado de la actividad de la proteína Dicer y, aparentemente, son sintetizados por la ARN polimerasa dependiente de ARN ( ARN polimerasa  dependiente de ARN, RdRP ) [47] [48] .

Silenciamiento de la transcripción

Muchos eucariotas utilizan el sistema de interferencia de ARN para mantener la estructura del genoma . La modificación química de las histonas y la transición de las secciones correspondientes de los cromosomas al estado de heterocromatina conduce a una disminución en la transcripción de los genes correspondientes [49] ; este proceso se refiere al silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS ) y lo lleva a cabo un conjunto complejo de proteínas .  En la levadura de fisión , este complejo contiene Argonaute , una proteína con el cromodominio Chp1, y una proteína llamada Tas3 con una función desconocida [50] . Como consecuencia, la inducción y expansión de las regiones de heterocromatina requiere la presencia de proteínas Argonaute y ARN polimerasa dependiente de ARN [51] . De hecho, la eliminación de estos genes en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe altera la metilación de histonas y la formación de centrómeros [52] y hace que la anafase disminuya o se detenga durante la división celular [53] . En algunos casos, tales procesos están asociados con la modificación de histonas y se ha demostrado que aumentan la transcripción de los genes correspondientes [54] .

El mecanismo por el cual el complejo RITS induce la formación de heterocromatina no se comprende completamente. Una parte importante de la investigación está dirigida a estudiar la región del genoma de la levadura que regula la región de tipo de apareamiento  , sin embargo, esta región puede no ser representativa en el caso de los genomas de otros organismos. Para preservar las regiones existentes de heterocromatina, RITS forma complejos con pequeños ARN de interferencia complementarios a los genes correspondientes y se une fuertemente a las histonas metiladas. Luego, RITS actúa en el momento de la transcripción para degradar cualquier pre-ARNm sintetizado por la ARN polimerasa. La formación de estas regiones de heterocromatina requiere la enzima Dicer, que sintetiza siRNA complementarios primarios implicados en la degradación del transcrito [55] . Mantener las regiones cromosómicas en un estado de heterocromatina parece ser un ejemplo de retroalimentación positiva , ya que los pequeños ARN de interferencia que forman parte de RITS se forman a partir de transcripciones aleatorias sintetizadas por la ARN polimerasa dependiente de ARN [56] . Los datos obtenidos en el estudio de las regiones centroméricas de los cromosomas de levadura probablemente no puedan extenderse a los mamíferos , ya que en estos últimos el mantenimiento de las regiones de heterocromatina no siempre depende del sistema de interferencia del ARN [57] .

Enlace a la edición de ARN

La forma más común de edición de ARN en eucariotas superiores es la conversión de adenosina en inosina en ARN de doble cadena , que se lleva a cabo por la enzima adenosina desaminasa [58] . En 2000, se sugirió que la vía de interferencia del ARN y la vía de edición del ARN A→I podrían competir por un sustrato de ARN bicatenario común [59] . De hecho, algunos pequeños precursores de ARN de interferencia pueden estar sujetos a la edición A→I [60] [61] , y este mecanismo puede regular el procesamiento y la expresión de moléculas de ARN de interferencia pequeñas maduras [ 61] [62] . Los estudios de líneas del gusano redondo Caenorhabditis elegans que carecen de la enzima de edición de ARN A→I han demostrado que la edición de ARN puede prevenir el silenciamiento de genes endógenos y transgenes a través de la vía de interferencia de ARN [63] .

Diferencias entre organismos

Los organismos difieren en su capacidad para percibir ARN extraño de doble cadena y usarlos en el proceso de interferencia de ARN. Los efectos del ARNi en plantas y Caenorhabditis elegans (pero no en Drosophila y mamíferos ) pueden ser hereditarios o sistémicos. En las plantas, el sistema de interferencia de ARN puede propagar pequeños ARN de interferencia a lo largo de los plasmodesmos (canales en las paredes celulares que llevan a cabo la comunicación y el transporte) [23] . La herencia está asegurada por la metilación de los promotores , el patrón de metilación alterado se transmite como resultado de la división a las células hijas [65] . Las diferencias significativas en los objetivos de los pequeños ARN de interferencia entre plantas y animales se deben al hecho de que en las plantas los microARN son altamente complementarios a los objetivos ribonucleicos y provocan la degradación del ARNm en RISC, mientras que en los animales los pequeños ARN de interferencia difieren mucho en la secuencia de nucleótidos y causan la represión de los mismos. traducción [64] . Los microARN pueden influir en el inicio de la traducción al interactuar con factores de iniciación de la traducción y con el tracto poli(A) de ARNm [66] .

Algunos protozoos, como Leishmania major y Trypanosoma cruzi , no tienen ningún componente de la vía de interferencia del ARN [67] [68] . La mayoría de los componentes del sistema de interferencia de ARN también están ausentes en algunos hongos, por ejemplo, en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae [69] . Se ha demostrado la presencia de componentes del sistema de interferencia de ARN en otras levaduras de fisión, como Saccharomyces castellii y Candida albicans . La inducción de dos proteínas del sistema de interferencia de ARN de Saccharomyces castellii facilita este proceso en Saccharomyces cerevisiae [70] . El hecho de que algunos ascomicetos y basidiomicetos no tengan una vía de interferencia de ARN indica que los genes que codifican las proteínas requeridas para este proceso se han perdido de forma independiente en muchos linajes fúngicos, probablemente debido a la evolución de una nueva vía con funciones similares, o debido a la pérdida de ventaja adaptativa en estos nichos ecológicos [71] .

Análogos de ARNi en procariotas

La expresión génica en procariotas está regulada por un sistema basado en ARN similar en algunos aspectos al sistema de interferencia de ARN. En procariotas, se han descrito genes que codifican ARN especiales que controlan la propagación y traducción de ARNm al emparejarse con secuencias complementarias. Sin embargo, estos ARN reguladores no son análogos completos de los pequeños ARN de interferencia , ya que la enzima Dicer no está involucrada en este proceso [72] . Se ha demostrado que en procariotas el sistema de repeticiones palindrómicas cortas dispuestas regularmente en grupos ( CRISPR ) es similar al sistema de interferencia de ARN en eucariotas, aunque no se conocen proteínas eucariotas homólogas para ninguno de los componentes del sistema procariota [73] .

Funciones biológicas

Inmunidad

El sistema de interferencia de ARN es una parte importante de la respuesta inmune a los virus y otro material genético extraño . En las plantas, el sistema de interferencia de ARN evita la propagación de transposones [74] . Las plantas tienen varios homólogos de la proteína Dicer que se dirigen contra diferentes tipos de virus [75] . Se ha demostrado que el silenciamiento génico inducido en las plantas puede transmitirse desde el patrón a la planta injertada [76] . Esta característica del sistema inmunitario adaptativo de las plantas permite, después de la penetración local inicial del virus, responder a penetraciones repetidas del virus en todo el cuerpo [77] . En respuesta, muchos virus evolucionaron para adquirir mecanismos que suprimen el sistema de interferencia del ARN en las células vegetales [78] . Se han descrito proteínas víricas que se unen a fragmentos cortos de ARN bicatenario con protuberancias monocatenarias resultantes de la actividad de la proteína Dicer [79] . Algunas plantas expresan pequeños ARN de interferencia endógenos en respuesta a la infección con ciertas bacterias [80] . Estos efectos pueden ser parte de una respuesta general a los patógenos , en la que muchos procesos metabólicos del huésped se reducen en respuesta a la infección [81] .

Aunque las células animales tienden a expresar menos variantes de la enzima Dicer que las plantas, el sistema de interferencia de ARN en animales se ha implicado en la respuesta antiviral en algunos casos. La interferencia de ARN en Drosophila juvenil y adulta juega un papel importante en la inmunidad antiviral innata y está involucrada en la defensa contra patógenos como el virus Drosophila X.[82] [83] . El sistema de interferencia de ARN en Caenorhabditis elegans desempeña un papel similar en la inmunidadproteínas Argonaute aumenta durante la infección viral, mientras que los gusanos en los que aumenta la expresión de genes de la vía de interferencia de ARN se vuelven resistentes a la infección viral [84] [85] .

El papel del sistema de interferencia de ARN en la inmunidad innata de los mamíferos no se comprende completamente. Sin embargo, el hecho de que algunos virus contengan genes que reducen la respuesta del sistema RNAi en células de mamíferos indica la presencia de una respuesta inmune provocada por el sistema RNAi [86] [87] . Sin embargo, la hipótesis de la inmunidad mediada por el sistema de interferencia de ARN en los mamíferos no está suficientemente fundamentada [88] . Aunque recientemente Maillard et al. [89] y Lee et al. [90] presentó nuevas pruebas de la existencia de una vía de interferencia de ARN antiviral funcional en células de mamíferos. Los pequeños ARN de interferencia expresados ​​por el virus del herpes pueden provocar la formación de heterocromatina y provocar la transición del virus a un estado latente [91] .

Se demostró que la eliminación de una copia del gen Dicer1 en ratones conducía a la aparición de más tumores que en el grupo de control, así como a una disminución de los niveles de miARN y de la supervivencia. La eliminación completa del gen Dicer1 bloqueó la formación de tumores, probablemente también porque se requiere cierto nivel de expresión del producto del gen Dicer1 para el crecimiento celular. [92]

Los trabajos en 2013 mostraron que las células de mamíferos tienen un sistema de interferencia de ARN que exhibe actividad antiviral. [93] [94] Otras funciones del sistema de ARNi de los mamíferos son los microARN del virus del herpes simple, que actúan como organizadores de la heterocromatina y conducen a la latencia del virus. [95]

Expresión génica

Cuando se reprime la traducción [64] , en algunas etapas del desarrollo de los organismos vivos, especialmente en la etapa de morfogénesis y mantenimiento de las células en un estado indiferenciado (por ejemplo, en el caso de las células madre ), los miARN expresados ​​endógenamente , que son Los productos de las regiones de intrones e intergenes son de gran importancia [96] . El papel de dichos microARN expresados ​​endógenamente en la supresión de la expresión génica se describió por primera vez en el nematodo Caenorhabditis elegans en 1993 [97] . En plantas, dicha función de miARN se describió por primera vez en la planta modelo Arabidopsis thaliana , para la cual se demostró la influencia de "JAW miRNA" en la regulación de varios genes que controlan la apariencia [98] . En las plantas, los genes regulados por microARN suelen ser factores de transcripción [99] , por lo que los microARN regulan redes de genes completas al alterar la expresión de genes clave (incluidos los factores de transcripción y las proteínas F-box ) durante el desarrollo embrionario [100] . En muchos organismos, incluidos los humanos, los microARN están involucrados en la formación de tumores y la desregulación del ciclo celular . En este caso, los miARN pueden ser tanto oncogenes como supresores de tumores [101] .

Las secuencias de pequeños ARN y miARN de interferencia son complementarias a las secuencias de nucleótidos de las regiones promotoras. La unión de siRNA y miRNA a estas regiones puede conducir a un aumento en la transcripción de genes y la activación del ARN . Se produce un aumento en la expresión de estos genes con la participación de las proteínas Dicer y Argonaute , y también se produce la desmetilación de histonas [102] [103] .

Evolución

Los métodos de análisis filogenético computacional indican que el ancestro común más reciente de todos los eucariotas tenía ARN de interferencia, mientras que la ausencia de un sistema de ARN de interferencia en algunos eucariotas es un rasgo adquirido [104] . Una vía de interferencia de ARN evolutivamente antigua parece haber contenido enzimas similares a Dicer , Argonaute , PIWI , así como ARN polimerasa dependiente de ARN. Probablemente, junto con la interferencia del ARN, estas enzimas también desempeñaron otras funciones en la célula. Los estudios a gran escala en el campo de la genómica comparativa indican que un pequeño grupo que se convirtió en el ancestro de todos los eucariotas también tenía componentes estrechamente relacionados con los sistemas de degradación del ADN, por ejemplo, similares a los complejos exosomales [105] . La familia de proteínas Argonaute, común a muchos eucariotas, así como a arqueas y algunas bacterias (p. ej ., Aquifex aeolicus ), se deriva homóloga y evolutivamente de componentes del sistema de iniciación de la traducción [ 105] .

La función más antigua del sistema de interferencia de ARN, por regla general, se denomina protección contra elementos genéticos exógenos: los genomas de virus y transposones [104] [106] . Algunas funciones relacionadas, como la modificación de histonas , pueden haber estado presentes en los ancestros de los eucariotas modernos, mientras que otras, como la regulación del desarrollo por miARN, parecen haber aparecido más tarde [104] .

Los genes del sistema de interferencia de ARN en muchos eucariotas son componentes del sistema inmunitario innato que resiste a los virus. Algunos virus de plantas han adquirido mecanismos para suprimir la respuesta del sistema de interferencia de ARN de la célula huésped [78] . La tasa de cambio en los genes de la ruta de interferencia del ARN en Drosophila está dirigida por selección positiva . Los genes del sistema de interferencia de ARN evolucionan a un ritmo muy elevado en comparación con otros genes del genoma de Drosophila [107] .

Aplicación

Desactivar genes

El sistema de interferencia de ARN se utiliza a menudo en biología experimental para estudiar la función de los genes en cultivos celulares y en organismos modelo in vivo [1] . El ARN sintético de doble cadena complementario a un gen determinado se introduce en una célula u organismo, donde una molécula de ARN extraña desencadena un sistema de interferencia de ARN. Este método permite a los investigadores reducir significativamente el nivel de expresión del gen correspondiente. Estudiar las consecuencias de una disminución en la expresión de un gen de interés permite dilucidar el papel fisiológico del producto de este gen diana. Dado que el sistema de interferencia de ARN no puede desactivar por completo la expresión génica, este método se denomina " eliminación de genes ", en contraste con la eliminación completa del gen, " inactivación de genes " [108] .

Los avances significativos en biología computacional están permitiendo el desarrollo de ARN de doble cadena que proporcionan la máxima reducción en la expresión del gen objetivo y tienen efectos secundarios mínimos. Los efectos secundarios pueden ocurrir cuando la molécula de ARN inyectada tiene una secuencia que es complementaria a varios genes al mismo tiempo, lo que conduce a una disminución insuficiente en la expresión de varios genes. A menudo surgen dificultades similares cuando el ARN de doble cadena contiene secuencias repetitivas. Los estudios de los genomas de Homo sapiens , Caenorhabditis elegans y Schizosaccharomyces pombe han demostrado que alrededor del 10 % de las moléculas pequeñas de ARN que interfieren producirán efectos secundarios significativos [ 42 ] , incluidos los específicos de los mamíferos [111] y los virus [112] . Las secuencias de siRNA sugeridas se verifican automáticamente para detectar actividad cruzada.

Dependiendo del organismo y del sistema experimental, los ARN exógenos pueden diseñarse para ser largos y ser el objetivo de la proteína Dicer, o cortos y ser sustratos de pequeños ARN de interferencia. Para la mayoría de las células de mamíferos, se prefieren los ARN más cortos porque los ARN largos de doble cadena en los mamíferos provocan una respuesta de interferón , una forma de inmunidad innata , una respuesta no específica al material genético extraño [113] . Para los ovocitos de ratón , así como para las células de embriones de ratón en las primeras etapas de desarrollo, la respuesta del interferón al ARN exógeno de doble cadena no es característica, por lo tanto, estas células son un sistema conveniente para estudiar la eliminación de genes en mamíferos [114] . Para utilizar el sistema de interferencia de ARN en el laboratorio, se han desarrollado métodos especiales que no requieren la introducción directa de pequeños ARN de interferencia en la célula, por ejemplo, sistemas de transfección de plásmidos que codifican secuencias de ARNsi transcritas [115] , vectores lentivirales que permiten inducir o inactivar transcripción, también llamada inglés. ARNi condicional [116] [117] .  

El método CRISPRi proporciona una estrategia alternativa para la regulación génica artificial de la interferencia del ARN , que opera en el nivel de activación/desactivación de la transcripción [118].

Genómica funcional

Los métodos de genómica funcional que utilizan el sistema RNAi generalmente se usan en Caenorhabditis elegans [120] y Drosophila melanogaster [121] , ya que estos animales son los modelos más utilizados y el sistema RNAi funciona de manera más eficiente en estos organismos. Caenorhabditis elegans es un objetivo conveniente para los estudios de interferencia de ARN por dos razones: en primer lugar, los efectos del silenciamiento de genes en el nematodo se heredan y, en segundo lugar, porque la entrega de ADN de doble cadena al nematodo es extremadamente simple. Los nematodos pueden alimentarse con células bacterianas, como Escherichia coli , que contienen el ARN de doble cadena deseado, que luego se absorbe a través de los intestinos. Este método de administración de ARN con alimentos es efectivo en términos de eficiencia del silenciamiento génico y, al mismo tiempo, es mucho más barato, más simple y más rápido que sumergir gusanos en una solución que contiene ARN de doble cadena o introducir ARN de doble cadena en las gónadas [122] . En la mayoría de los otros organismos, la entrega de ARN de doble cadena parece ser mucho más laboriosa, pero se están intentando estudios del genoma a gran escala en cultivos de células de mamíferos [123] .

Los enfoques para la creación de bibliotecas de ARN de interferencia para genomas completos son mucho más complicados que en el caso de un conjunto específico de pequeños ARN de interferencia para un experimento determinado. Las redes neuronales artificiales se utilizan a menudo para crear bibliotecas de siRNA, así como para predecir su eficacia para la desactivación de genes [124] [125] . Las pantallas genómicas masivas son técnicas prometedoras para la anotación del genoma, lo que ha llevado al desarrollo de métodos de detección de alto rendimiento basados ​​en la tecnología de micromatrices de ADN [126] [127] . La posibilidad de utilizar estos métodos para estudiar otros organismos, como los gusanos redondos parásitos, sigue siendo cuestionable [128] [129] .

La investigación de genómica funcional que utiliza técnicas de interferencia de ARN es atractiva para el mapeo del genoma y la anotación de genes en plantas, ya que muchas plantas son poliploides , lo que dificulta el estudio utilizando métodos tradicionales de ingeniería genética . Por ejemplo, la interferencia de ARN se ha utilizado con éxito en genómica funcional para estudiar Triticum aestivum (hexaploid) [130] , así como en el caso de otras plantas modelo, Arabidopsis thaliana y maíz [131] .

Medicina

Es posible utilizar métodos de interferencia de ARN en terapia , en particular en terapia de ARN . Aunque la introducción de ARN largos de doble cadena en las células de los mamíferos es difícil debido a la respuesta del interferón, se han utilizado con éxito moléculas como los ARN de interferencia pequeños [132] . Se han realizado ensayos clínicos de terapia de degradación de la retina y tratamiento del virus respiratorio sincitial mediante ARN de interferencia [133] , y también se ha demostrado la eficacia del sistema RNAi para el tratamiento del daño hepático en ratones de laboratorio [134] .

Otra posible aplicación clínica de la interferencia de ARN es el tratamiento del virus del herpes simple tipo 2 (por ejemplo, en la Escuela de Medicina de la Universidad de Harvard ) y la inhibición de la expresión génica viral en las células tumorales [135] , la eliminación de los receptores y correceptores del VIH del huésped [136 ] , silenciamiento de los genes de la hepatitis A [137] y hepatitis B [138] , silenciamiento del gen del virus de la influenza [139] , inhibición de la replicación del virus del sarampión [140] . También es posible tratar enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Huntington [141] . La interferencia de ARN también se considera a menudo una forma prometedora de tratar los tumores al desactivar los genes que se sobreexpresan en las células tumorales o los genes implicados en la división celular [142] [143] . Un área importante de investigación en el campo de la interferencia de ARN para aplicaciones clínicas es el desarrollo de métodos para la entrega segura de ARN pequeños, por ejemplo, la selección de sistemas de vectores para terapia génica [144] [145] .

A pesar de que existen nuevos estudios sobre cultivos celulares que confirman la posibilidad potencial de una terapia farmacológica basada en los componentes del sistema de interferencia de ARN, quedan dudas sobre la seguridad de dichos tratamientos, incluidas las consecuencias de los efectos secundarios de la represión de genes con nucleótidos similares. secuencias [ 146] . Los métodos de genómica computacional muestran que tales efectos secundarios de desvinculación son de hasta un 10 % [42] . Uno de los grandes estudios de enfermedades hepáticas en ratones mostró una mayor tasa de mortalidad entre los animales de experimentación, lo que los investigadores explicaron como una "sobrecarga" con ARN de doble cadena ( miARN , ARNsh ) [147] , ya que los ARN pequeños que contienen una horquilla son procesada en el núcleo y exportada al citoplasma por el mecanismo de transporte activo . Todos los hechos anteriores todavía se están investigando, lo que limita las aplicaciones potenciales de los métodos de interferencia de ARN para la terapia.

Además, un obstáculo significativo en el desarrollo de terapias de interferencia de ARN es que la entrega de pequeños ARN de interferencia (siARN) sigue siendo extremadamente ineficiente, y se necesitan dosis extremadamente altas del fármaco para lograr una eliminación mínimamente significativa del gen objetivo. Sin embargo, las tecnologías desarrolladas recientemente nos permiten esperar que este método de terapia entre pronto en la práctica clínica. Por ejemplo, se descubrió que la inyección simultánea de siRNA asociado al colesterol (chol-siRNA) y polímero endosomolítico ARC-520 hizo posible lograr un aumento de más de 500 veces en la eficiencia y una disminución del 90 % en la expresión del gen objetivo. en ratones in vivo. [148] .

Se están desarrollando métodos para usar la interferencia de ARN para tratar la infección persistente por VIH tipo 1. Los virus como el VIH-1 presentan un objetivo difícil para el sistema de ARNi, ya que requieren una combinación de múltiples vías de ARNi. Las posibles formas de terapia antiviral utilizando el sistema RNAi parecen prometedoras, pero también es extremadamente importante establecer muchos experimentos de control en ensayos preclínicos para mostrar sin ambigüedades la acción específica de secuencia del sistema RNAi [149] .

Biotecnología

La interferencia de ARN se utiliza en biotecnología , en particular para crear plantas que sintetizan sustancias tóxicas naturales en cantidades más bajas. Se han desarrollado métodos para crear plantas que expresen de manera estable los componentes del sistema de interferencia de ARN, por ejemplo, las semillas de algodón normalmente son ricas en proteínas adecuadas para el consumo humano, pero contienen el terpenoide tóxico gosipol .  Los métodos que utilizan el fenómeno de la interferencia del ARN permiten crear líneas de algodón con un nivel reducido de la enzima clave para la síntesis de gosipol, (+)-δ-cadineno sintasa. Al mismo tiempo, otras partes de la planta expresan esta enzima al nivel habitual, ya que el gosipol es un compuesto importante que protege a las plantas de las plagas [150] . Se están realizando intentos similares para reducir los niveles de cianuro en el producto natural linamarina , derivado de la mandioca ( Manihot esculenta ) [151] .

Se han desarrollado métodos para reducir los niveles de alérgenos en las plantas de tomate [152] y métodos para reducir los precursores de carcinógenos en las plantas de tabaco [153] . Otros ejemplos de cambios genéticamente modificados en las plantas son la creación de adormidera con niveles reducidos de sustancias narcóticas [154] , el aumento de la resistencia de las plantas a los virus [155] y la adición de antioxidantes a los frutos de tomate [156] . Las plantas comerciales genéticamente modificadas anteriores, el tomate y la papaya , se desarrollaron utilizando ARN antisentido, aparentemente operando por interferencia de ARN [157] [158] . Usando interferencia de ARN, científicos de Uzbekistán suprimieron la función del gen del fitocromo A en el algodón. Como resultado se obtuvieron líneas de algodón en las que se mejoraron simultáneamente varias características importantes: longitud y calidad de fibra, rendimiento, tiempo de maduración, resistencia a la deficiencia hídrica y al estrés salino. Sobre la base de las líneas de algodón obtenidas, se crearon nuevas variedades de algodón de alta calidad de la serie Porlock, que actualmente se siembran en los campos de Uzbekistán. La fibra de estas variedades se vende a un precio superior al del algodón común, ya que en cuanto a características de calidad son superiores a las fibras del algodón común [159] .

Notas

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Enlaces

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• Animación del proceso de interferencia de ARN de Nature
• Animación del proceso de interferencia del ARN con subtítulos y explicaciones en ruso
• NOVA scienceNOW sobre el proceso de ARNi, video de 15 minutos
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• Protocolo de uso de ARN de interferencia en C. elegans en formato de 96 pocillos para estudiar interacciones genéticas
• Molecular Therapy: The Development of RNAi in Therapeutics, una colección de artículos de acceso abierto de la revista Nature

diccionarios y enciclopedias	Gran danés gran ruso Britannica (en línea)
En catálogos bibliográficos	NKC : ph578234