Síntesis de oligonucleótidos

La síntesis de oligonucleótidos  es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácidos nucleicos con una estructura química dada (secuencia). El método se utiliza en la práctica de laboratorio moderna para obtener oligonucleótidos de la secuencia deseada de forma rápida y económica.

El método más común para la síntesis de oligonucleótidos se basa en el uso de amidofosfitos  , bloques de construcción que son derivados reactivos de desoxirribonucleósidos ( dA , dC , dG , T ) o ribonucleósidos ( A , C , G , U ) y permiten la síntesis de fragmentos cortos de ADN y ARN , respectivamente . También se utilizan otros amidofosfitos que permiten introducir nucleósidos modificados, diversos marcadores y grupos funcionales en la cadena de producción . Durante la síntesis, estos reactivos se agregan a su vez, en el orden especificado por la secuencia del producto objetivo, a la cadena que crece sobre el soporte en fase sólida . Este proceso se automatizó por completo a fines de la década de 1970 y actualmente se realiza en sintetizadores dedicados controlados por computadora.

Una vez completada la síntesis, el oligonucleótido se separa del vehículo, los grupos protectores utilizados durante la síntesis se eliminan y el producto resultante se purifica mediante electroforesis o HPLC .

Los oligonucleótidos sintéticos se utilizan ampliamente en biología molecular y medicina, por ejemplo, como oligonucleótidos antisentido , cebadores para secuenciación y amplificación de ADN , sondas para determinar secuencias complementarias de ADN y ARN, herramientas para la introducción dirigida de mutaciones y sitios de restricción , y para la síntesis de genes artificiales .

Historia

Durante la evolución de la síntesis de oligonucleótidos, se han desarrollado cuatro métodos principales para crear enlaces entre nucleósidos . Estos métodos se analizan en detalle en revisiones detalladas de la literatura [1] [2] [3] .

Primeros trabajos y el método moderno de H-fosfonato

A principios de la década de 1950, el grupo de Alexander Todd de Cambridge sentó las bases de los métodos de H-fosfonato y fosfotriéster para la síntesis de oligonucleótidos [4] [5] sintetizando clorofosfato 4 protegido , haciéndolo reaccionar con timidina 5 protegida en 3' y confirmando la estructura del dinucleótido 6 protegido resultante por escisión enzimática. Por extraño que parezca, no se llevó a cabo más trabajo en esta dirección en Cambridge (Todd señaló en su autobiografía que la síntesis de oligonucleótidos no le atraía) [1] .

El trabajo de Todd no volvió hasta treinta años después, cuando dos grupos de investigación adaptaron la condensación de H-fosfonato a la síntesis en fase sólida utilizando nucleósidos H-fosfonatos como componentes básicos y cloruro de pivaloílo, cloruro de 2,4,6-triisopropilbencenosulfonilo (TIPS- Cl) y otros compuestos - como activadores [6] [7] . En la práctica, el método se organizó como un ciclo de síntesis simple que consta de dos etapas: eliminación de la protección de dimetoxitritilo y condensación.

La oxidación del enlace diéster H-fosfonato entre nucleósidos en este método se lleva a cabo después de la síntesis de la cadena de oligonucleótidos bajo la acción de una solución de yodo en piridina acuosa . Si es necesario, la oxidación puede llevarse a cabo en ambientes anhidros [8] . El método también hace posible sintetizar tiofosfato [9] y selenofosfato [10] análogos de oligonucleótidos. La oxidación con tetracloruro de carbono en presencia de aminas primarias y secundarias conduce a análogos de amidofosfato [11] [12] .

Como regla general, el grupo 5'-hidroxilo en todos los 3'-H-fosfonatos de nucleósidos y el grupo amino en los H-fosfonatos de nucleósidos con bases A, G y C están protegidos antes de su uso en la síntesis por los mismos grupos que en el método del amidofosfito . Sin embargo, la protección de los grupos amino no es estrictamente necesaria [8] [13] .

Método del fosfodiéster

En la década de 1950, Har Gobind Korana y colaboradores desarrollaron un método de fosfodiéster en el que el 3' - O -acetilnucleósido-5'- O - fosfato se activaba con N , N' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) o cloruro de p -toluenosulfonilo ( TsCl ) y luego se inyecta en reacción con un nucleósido protegido en 5' - O para formar monofosfato de dinucleósido [14] . Después de la eliminación del grupo acetilo protector en el medio básico, se llevó a cabo una mayor elongación de la cadena. Se sintetizaron conjuntos de oligonucleótidos tri y tetrámero mediante condensación por etapas. Además, se llevó a cabo la condensación de fragmentos oligoméricos para obtener oligonucleótidos más largos [1] .

No se utilizó la protección de los grupos fosfato en la síntesis de fosfodiéster y esto, aparentemente, condujo a reacciones secundarias y redujo el rendimiento de la síntesis. Sin embargo, Korana creía que colocar protección en los grupos fosfato conduciría a la pérdida de la principal ventaja de los oligonucleótidos: su naturaleza polielectrolítica , que, en su opinión, podría usarse de manera efectiva para purificar los oligonucleótidos. Un descubrimiento importante del Corán fue el uso de grupos protectores de tritilo para proteger los nucleósidos 5'-hidroxilo [1] .

Método del fosfotriéter

En la década de 1960, grupos dirigidos por R. Letsinger ( ing.  R. Letsinger ) [15] [16] y K. Reese ( ing.  C. Reese ) [17] desarrollaron el método del fosfotriéster. La diferencia definitoria con el enfoque del fosfodiéster es la protección preliminar del fosfato en el reactivo y el producto con el grupo cianoetilo -CH 2 CH 2 CN. Este cambio eliminó la posibilidad de ramificar los oligonucleótidos en los grupos fosfato. La mayor selectividad del método permitió utilizar catalizadores y reactivos de condensación más reactivos [18] [19] , lo que redujo significativamente la duración de la síntesis. El método del fosfotriéster se implementó tanto en solución como en fase sólida [1] .

Con este método, fue posible sintetizar dos oligonucleótidos de doble cadena de 77 y 104 pares de bases de longitud, cuya secuencia correspondía a las cadenas A y B de la insulina , lo que posteriormente permitió expresar con éxito estos genes [1] .

Método de triéster de fosfito

En la década de 1970, se introdujo en la práctica el método de triéster de fosfito para la formación de enlaces internucleosídicos, en el que se utilizaron derivados de nucleósidos mucho más reactivos basados ​​en P(III), originalmente clorofosfitos [20] . Más tarde, un grupo dirigido por M. Caruthers utilizó fosfitos de 1H -tetrazolida menos agresivos y más selectivos e implementó el método en una versión de fase sólida [21] . Poco tiempo después, los empleados del mismo grupo mejoraron el método utilizando los nucleósidos amidofosfitos más estables como componentes básicos . El reemplazo del grupo protector fosfato de metilo menos práctico [22] [23] [24] por el grupo 2-cianoetilo más conveniente [25] dio lugar a la variante de nucleósido amidofosfitos, que sigue siendo el reactivo estándar para la síntesis de oligonucleótidos en la actualidad. Numerosas mejoras adicionales en los métodos para sintetizar bloques monoméricos, sintetizadores de oligonucleótidos y protocolos de ensamblaje y desbloqueo han convertido el enfoque del amidofosfito en un método muy confiable y productivo para obtener oligonucleótidos sintéticos [26] .  

Síntesis por el método del amidofosfito

Bloques de construcción

Amidofosfitos nucleósidos

En 1976, Letsinger y colaboradores encontraron que los compuestos de fósforo trivalente son reactivos mucho más activos que los correspondientes derivados de fósforo pentavalente. El papel de los compuestos P(III) se hizo evidente después del desarrollo de derivados de fosfito de N,N -diisopropilamida de nucleósidos ( amidofosfitos de nucleósidos ) [1] [22] por M. Carruthers , que aún desempeñan el papel de bloques de construcción estándar en la amida. método de síntesis de fosfito en la actualidad. Para evitar reacciones secundarias no deseadas, los grupos funcionales de los amidofosfitos deben bloquearse con grupos protectores . Una vez que se completa el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos, se eliminan todos los grupos protectores, lo que da como resultado el oligonucleótido objetivo. A continuación se muestran los grupos protectores utilizados en los nucleósidos amidofosfitos estándar disponibles en el mercado [27] :

  • El grupo hidroxilo en la posición 5' está protegido por un grupo protector 4,4'-dimetoxitritilo (DMT), que se elimina en condiciones ácidas.
  • La timina y el uracilo , las bases nitrogenadas de la timidina y la uridina , respectivamente, no tienen grupos amino exocíclicos, por lo que no necesitan grupos protectores. La guanina tiene un grupo amino exocíclico de baja basicidad , por lo que no reacciona lateralmente con los amidofosfitos en condiciones de reacción de condensación. Sin embargo, el reactivo de amidofosfito basado en 5'- O -DMT-2'-desoxiguanosina N2-sin proteger es poco soluble en acetonitrilo  , el disolvente más comúnmente utilizado en la síntesis de oligonucleótidos. Por el contrario, los derivados protegidos con N2 del mismo compuesto son altamente solubles en acetonitrilo y, por lo tanto, se usan mucho más ampliamente. Las bases nitrogenadas adenina y citosina contienen grupos amino que pueden reaccionar con los amidofosfitos durante la síntesis y, por lo tanto, estos grupos deben protegerse para la síntesis en condiciones estándar. Sin embargo, mediante la introducción de etapas adicionales en el ciclo de síntesis, es posible lograr el uso de amidofosfitos dA y dC desprotegidos [28] . Los grupos protectores sobre bases nitrogenadas deben conservarse durante toda la síntesis, por lo que se utilizan grupos cuya reactividad es opuesta a la del grupo 4,4'-dimetoxitritilo, que se elimina después de cada ciclo. Los dos enfoques más utilizados se describen a continuación.
    • En el primer enfoque estándar, la protección de benzoílo (Bz) se usa para proteger la adenina y la citosina , mientras que la guanina está protegida por un grupo isobutirilo ( i Bu) [29] . Más tarde , se propuso un grupo acetilo (Ac) para proteger la citosina , que se puede eliminar con amoníaco o una mezcla de amoníaco y metilamina [30] .
    • En el segundo esquema de protección, más suave, la adenina está protegida por grupos isobutirilo [31] o fenoxiacetilo (PAC) [32] . La citosina contiene un grupo protector acetilo [30] , mientras que la guanina está protegida por grupos 4-isopropilfenoxiacetilo ( i Pr-PAC) [33] o dimetilformamidina (dmf) [34] . Los grupos protectores blandos se eliminan más fácilmente que los estándar; sin embargo, los amidofosfitos con estos grupos son menos estables cuando se almacenan en solución.
  • El grupo fosfito está protegido por un grupo 2-cianoetilo [25] . La presencia de protección de fosfito es obligatoria para el amidofosfito y el grupo triéster de fosfito recién formado antes de que este último se oxide al fosfotriéster. Al mismo tiempo, la presencia de protección en los grupos fosfato de un fragmento de oligonucleótido ya ensamblado no es necesaria para ciclos de condensación posteriores exitosos [35] .
  • La síntesis de ARN utiliza bloques de construcción con un grupo 2'-hidroxilo "extra" que no está involucrado en la síntesis. Está protegido con un grupo terc -butildimetilsililo (TBDMS) [36] [37] [38] o triisopropilsililoximetilo (TOM) [39] [40] . Ambos grupos son eliminados por la acción del ion fluoruro .
  • El grupo fosfito también contiene un grupo diisopropilamina ( i -Pr 2 N) reactivo en condiciones ácidas. Tras la activación bajo la acción de un catalizador ácido, este grupo es reemplazado por el grupo 5'-hidroxilo de la cadena en crecimiento [22] .
Amidofosfitos no nucleósidos

Los amidofosfitos no nucleósidos son reactivos de amidofosfitos diseñados para introducir una variedad de grupos funcionales y etiquetas en la posición terminal de un oligonucleótido o entre residuos de nucleótidos en el medio de una secuencia. Para que sea adecuado para la introducción en la mitad de la cadena, el amidofosfito debe contener al menos dos grupos hidroxilo, uno de los cuales está protegido por un grupo DMT y el otro lleva un resto amidofosfito reactivo.

Los amidofosfitos no nucleósidos se utilizan para introducir en el oligonucleótido varios grupos que no se encuentran en los nucleósidos naturales. Se ha sintetizado una amplia gama de reactivos similares, que sirven, por ejemplo, para la introducción de grupos 5'-fosfato [41] , grupo amino [42] , grupo mercapto [ 43] , aldehído [44] y carboxilo [45] , fragmentos de alquinos [46] , colorantes fluorescentes [47] y extintores, modificaciones hidrofílicas [48] e hidrofóbicas [49] , biotina [50] , etc.

Ciclo sintético

La síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo mediante la condensación por etapas de los bloques de construcción en el extremo 5' de la cadena en crecimiento hasta que se ensambla la secuencia objetivo. La aparición de reacciones secundarias impone una limitación en la longitud del oligonucleótido sintetizado (hasta 200 residuos de nucleótidos ), ya que el número de errores se acumula con un aumento en la longitud del producto objetivo [26] . El conjunto de operaciones requeridas para extender la cadena en un residuo de nucleótido se denomina ciclo de síntesis y consta de cuatro reacciones químicas.

Etapa 1: Eliminación de la protección de tritilo

El grupo protector DMT se elimina con una solución ácida, como ácido tricloroacético al 2% o ácido dicloroacético al 3% en un disolvente inerte ( cloruro de metileno o tolueno ). El catión de dimetoxitritilo naranja resultante se lava del sistema. Como resultado, se forma un precursor de oligonucleótido con un grupo 5'-hidroxilo libre fijado en un vehículo en fase sólida. Llevar a cabo el proceso durante más tiempo o usar soluciones ácidas más concentradas conduce a una reacción secundaria de depuración  : la eliminación de las bases de purina del residuo de ribosa .

Etapa 2: Condensación

Una solución de nucleósido amidofosfito (0,02–0,2 M) o una mezcla de varios amidofosfitos en acetonitrilo se activa con una solución 0,2–0,7 M de un catalizador ácido a base de un azol : 1 H - tetrazol , 2-etiltiotetrazol [51] , 2 -benciltiotetrazol [52] , 4,5-dicianimidazol [53] , etc. La mezcla de componentes se produce en las líneas de comunicación del sintetizador durante la entrega de reactivos al reactor que contiene un vehículo en fase sólida. El amidofosfito activado en un exceso de 1,5 a 20 veces se introduce en interacción con el grupo 5'-hidroxilo, formando un enlace triéster de fosfito. La condensación de amidofosfitos de 2'-desoxinucleósidos transcurre muy rápidamente y tarda, por regla general, unos 20 segundos a pequeña escala. Los amidofosfitos estéricamente impedidos de los ribonucleósidos reaccionan mucho más lentamente (5-15 min) [54] [55] [56] [57] . La reacción es bastante sensible a la presencia de agua, especialmente cuando se utilizan soluciones diluidas de amidofosfitos, por lo que se lleva a cabo en un disolvente anhidro, normalmente acetonitrilo . Con un aumento en la escala de síntesis, se utilizan excesos más pequeños y soluciones más concentradas de amidofosfitos. Una vez completada la reacción, los reactivos en exceso y los subproductos se eliminan del reactor mediante lavado.

Etapa 3: Capping

El taponamiento se lleva a cabo tratando un vehículo en fase sólida con una mezcla de anhídrido acético y 1-metilimidazol (con menos frecuencia DMAP ) como catalizador . Dentro de la síntesis de amidofosfito, este paso tiene dos propósitos:

  • Después de completar la etapa de condensación, una pequeña fracción de los grupos 5'-hidroxilo (0.1-1%) permanece sin reaccionar y debe eliminarse del proceso de elongación adicional de la cadena para evitar la formación de oligonucleótidos con residuos de nucleótido faltantes dentro. La cadena. Para ello, los grupos hidroxilo restantes se protegen con grupos acetilo que son resistentes a las soluciones ácidas utilizadas para eliminar la protección DMT.
  • También se ha informado que los amidofosfitos activados con 1H -tetrazol reaccionan con bajo rendimiento con el oxígeno del carbonilo en la posición O 6 de la guanosina [58] . Cuando se oxida con una mezcla de yodo y agua, este subproducto sufre la escisión de la base de purina . Los sitios de apurina resultantes se hidrolizan fácilmente durante la desprotección final del oligonucleótido, lo que da lugar a la formación de dos oligonucleótidos más cortos y a una disminución del rendimiento del producto objetivo. Las modificaciones de O 6 se eliminan rápidamente por la acción de un agente de protección si la protección se lleva a cabo antes de la etapa de oxidación.
Etapa 4: Oxidación

El grupo fosfito tricoordinado internucleósido obtenido como resultado de la condensación no es natural y tiene una estabilidad limitada en condiciones de síntesis. El tratamiento del soporte con yodo y agua en presencia de una base débil ( piridina , 2,6-lutidina o colidina ) oxida el fosfito a un fosfotriéster, un precursor del enlace internucleósido fosfodiéster natural. La oxidación también se puede llevar a cabo en condiciones anhidras usando hidroperóxido de terc-butilo [59] o un reactivo más conveniente, (1 S )-(+)-(10-canforsulfonil)oxaziridina [60] .

Portadores de estado sólido

A lo largo de la síntesis en fase sólida, el oligonucleótido se une covalentemente al vehículo en fase sólida a través del grupo 3'-hidroxilo. El soporte suele colocarse en columnas, cuyo tamaño depende de la escala de la síntesis. En los últimos 10 años se han generalizado los sintetizadores de oligonucleótidos de alto rendimiento, en los que el portador se coloca en los pocillos de la placa (96 o 384 pocillos por placa) [61] . Después del final de la síntesis, el oligonucleótido se escinde del soporte y se disuelve.

Material multimedia
Tamaño de poro CPG, Å [62] Carga,
µmol/g		 Longitud del producto,
bases
500 80-90 <50
1000 50-60 80
1500 35-45 100
2000 20-30 150
3000 200

A diferencia de la síntesis orgánica en fase sólida y la síntesis de péptidos, la síntesis de oligonucleótidos avanza mejor en vehículos en fase sólida que no se hinchan o que se hinchan débilmente. Los soportes más utilizados son el vidrio de poro controlado (CPG) y el poliestireno macroporoso (MPPS) [ 63] . 

  • La característica principal de CPG es el diámetro de poro , que puede ser de 70 a 4000 Å , mientras que los poros son de tamaño muy uniforme (la desviación es de ±10% para el 80% de los poros). Para hacer que dicho soporte sea adecuado para la síntesis, se trata con (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) para dar aminopropil CPG. Aminoalquilo de cadena larga CPG , LCAA CPG también se utilizan a menudo [  63] . Dos características clave de la síntesis dependen del tamaño del poro: la escala, determinada por el número de grupos funcionales activos por unidad de masa del portador, y la longitud máxima del oligonucleótido sintetizado. Los datos sobre los portadores de CPG más comunes se dan en la tabla [62] .
  • También en la síntesis de oligonucleótidos se utiliza poliestireno macroporoso, obtenido por copolimerización de estireno y divinilbenceno , con la modificación aminometilo introducida. Este poliestireno permite sintetizar oligonucleótidos con una longitud inferior a 40-50 bases. Para síntesis pequeñas, se puede utilizar un soporte de poliestireno con una carga de 10 a 45 µmol/g. Para síntesis en una escala de 25 a 100 µmol, se utiliza poliestireno con una carga de 200 a 400 µmol/g. Finalmente, el poliestireno es más adecuado que el CPG para síntesis a gran escala (más de 100 µmol) [62] .
Química del enlazador

Para los fines de la síntesis de oligonucleótidos, los succinatos de nucleósidos o los enlazadores no nucleósidos se unen covalentemente a los grupos amino de aminopropil CPG, LCAA CPG o aminometil MPPS. Por lo general, se utilizan tres tipos diferentes de medios.

  • Portadores de nucleósidos . En el primer enfoque histórico, la síntesis de un oligonucleótido se lleva a cabo en un transportador, al que se une covalentemente un nucleósido iniciador en el extremo 3' por adelantado a través de un fragmento de ácido succínico . En consecuencia, la síntesis comienza con la adición de un amidofosfito correspondiente no al primero, sino al segundo nucleótido, contando desde el extremo 3'. La desventaja de dicho transportador es que antes de comenzar la síntesis, es necesario seleccionar la variante del transportador de nucleósido correspondiente al nucleósido terminal 3' en el oligonucleótido sintetizado, lo que reduce la productividad del proceso de síntesis y aumenta la probabilidad de error humano. [64] . También se han propuesto vehículos alternativos en fase sólida con un espaciador a base de ácidos diglicólico y oxálico para una separación más rápida del producto del vehículo [63] .
  • medios universales . En este método, la síntesis comienza con un transportador universal, al que se une un enlazador no nucleósido [65] . El amidofosfito, correspondiente al nucleósido 3'-terminal, se une al soporte universal de acuerdo con métodos estándar durante el primer ciclo sintético. Después de eso, continúa el ensamblaje de la secuencia deseada y luego el oligonucleótido se escinde de la superficie del soporte. La ventaja de este enfoque es que en todas las síntesis, independientemente de la secuencia que deba sintetizarse, se puede utilizar una única portadora universal [64] .
  • Se utilizan soportes especiales para unir algún grupo funcional o informador a la posición 3' de los oligonucleótidos sintéticos. Los vehículos están disponibles comercialmente para la introducción de grupos amino [66] , grupos mercapto [ 67] , extintores de fluorescencia [68] , etc.

Oligonucleótidos de tiofosfato y su síntesis

Los oligonucleótidos de tiofosfato son oligonucleótidos modificados en los que uno de los átomos de oxígeno del residuo de fosfato se reemplaza por un átomo de azufre . Solo se usan ampliamente aquellos tiofosfatos en los que el azufre no es un enlace entre el residuo de nucleósido y el átomo de fósforo. En este caso, el reemplazo de oxígeno con azufre conduce a la formación de un nuevo centro de quiralidad en el átomo P(V), por lo tanto, en el caso más simple de un dinucleótido, se forman los diastereómeros S P - y R P - . En un oligonucleótido n -mero en el que todos los enlaces internucleotídicos ( n - 1) son tiofosfato, el número de diastereoisómeros es 2 ( n - 1) . Como análogos no naturales de los ácidos nucleicos, los tiofosfatos de oligonucleótidos son significativamente más resistentes a la hidrólisis por nucleasas , una clase de enzimas que escinden los ácidos nucleicos por hidrólisis del enlace PO del puente fosfodiéster. Esta propiedad determina el uso de tiofosfatos como oligonucleótidos antisentido en aplicaciones in vivo e in vitro donde la exposición a nucleasas es inevitable. De manera similar, para aumentar la estabilidad de los ARN de interferencia pequeños , a menudo se introduce al menos un enlace de tiofosfato en la posición 3' de las cadenas sentido y antisentido. En los tiofosfatos de oligonucleótidos ópticamente puros, los diastereómeros en los que todos los centros de fósforo tienen la configuración S P son más resistentes a la hidrólisis enzimática que sus equivalentes R P. Sin embargo, la síntesis de tiofosfatos ópticamente puros es difícil [69] [70] .

La síntesis de tiofosfatos de oligonucleótidos es similar a la síntesis de oligonucleótidos naturales. La diferencia es que el paso de oxidación se reemplaza por una reacción de sulfuración. Los siguientes reactivos disponibles en el mercado se utilizan para la introducción de azufre:

  • El 3-(dimetilaminometilidenamino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona ( DDTT ) proporciona una alta tasa de sulfuración y es estable en solución [71] .
  • El reactivo de Beaucage  tiene una mayor solubilidad en acetonitrilo y permite que la reacción se lleve a cabo en menos tiempo . Sin embargo, tiene una estabilidad limitada en solución y es menos eficaz para sulfurar los enlaces de ARN [72] .
  • El disulfuro de N,N,N',N'-Tetraetiltiuram ( TETD ) es soluble en acetonitrilo, sin embargo, la reacción de sulfurización del enlace internucleósido del ADN tarda 15 min, lo que es 10 veces más lento que en el caso de los dos compuestos anteriores [ 73] .

También se han desarrollado otros reactivos sulfurantes [74] .

En la síntesis de oligonucleótidos de tiofosfato, el paso de protección se lleva a cabo después de la sulfurización. Si los tapones se llevan a cabo antes de la sulfuración, entonces, después del taponamiento, el vehículo en fase sólida puede contener cantidades residuales de anhídrido acético y 1-metilimidazol. La mezcla de cobertura dificulta la reacción de transferencia de azufre, lo que conduce a la formación de oligonucleótidos de tiofosfato con un mayor contenido de unidades de fosfato. En este caso, se recomienda realizar el taponado después de la reacción de sulfurización [71] .

Automatización

Anteriormente, la síntesis de oligonucleótidos se realizaba manualmente en solución o en fase sólida. Para la síntesis en fase sólida, se han adaptado diversos dispositivos basados ​​en jeringas con membranas porosas o filtros de vidrio en miniatura, que permiten lavar el portador en fase sólida con soluciones de reactivos y eliminarlos mediante vacío [76] .

En la actualidad, la síntesis en fase sólida se lleva a cabo automáticamente en sintetizadores de oligonucleótidos controlados por computadora. Estos dispositivos consisten en una serie de válvulas conectadas a contenedores de reactivos, así como solenoides que abren o cierran una u otra válvula. A su vez, los solenoides son controlados por una computadora que ejecuta el programa de síntesis. Cuando la válvula está abierta, se bombea un determinado reactivo a través de la columna que contiene el portador de fase sólida durante el tiempo especificado por el programa. El tiempo y la secuencia de suministro de reactivos es constante para cada ciclo de síntesis; la única variable es el reactivo monomérico que debe condensarse en un ciclo dado. Su selección también la realiza el programa de acuerdo con la secuencia de oligonucleótidos especificada [77] .

La síntesis se puede implementar en formato de columna, placa o chip. El método de síntesis en columna es adecuado para la investigación o la síntesis a gran escala de estos polímeros, donde no se requiere un alto rendimiento de su síntesis. El formato de la placa está diseñado específicamente para la síntesis de alto rendimiento a pequeña escala para satisfacer la creciente demanda de oligonucleótidos sintéticos en la industria y la ciencia. Varios tipos de sintetizadores están disponibles comercialmente [78] [79] [80] .

Procesamiento post-sintético

Para obtener el oligonucleótido diana, es necesario eliminar todos los grupos protectores del oligonucleótido:

  • un grupo 5' DMT;
  • grupos protectores de acilo sobre bases nitrogenadas;
  • Grupos 2-cianoetilo que protegen a los grupos fosfato internucleósidos.

El grupo 5'-DMT generalmente se elimina con una solución ácida durante la síntesis automática. La escisión del oligonucleótido del soporte, la desprotección de las bases y de los grupos protectores de cianoetilo suele ocurrir simultáneamente bajo la acción de bases inorgánicas o aminas . Por lo general, se utilizan para estos fines amoníaco acuoso , una solución de metilamina , sus mezclas [30] , amoníaco gaseoso o metilamina [81] , con menos frecuencia soluciones de otras aminas primarias y álcalis a temperatura ambiente o elevada. Este tratamiento elimina todos los grupos protectores de los 2'-desoxioligonucleótidos, dejando una solución del producto final. En el caso de los oligorribonucleótidos protegidos con 2'- O -sililo, se añade un paso para eliminar los grupos protectores de sililo bajo la acción del ion fluoruro [82] .

La aplicación de este método está limitada por el hecho de que este procesamiento produce acrilonitrilo como subproducto . En condiciones de desprotección, el acrilonitrilo puede alquilar bases nitrogenadas, principalmente la posición N3 de la timina y el uracilo , para formar derivados de 2-cianoetilo mediante la reacción de Michael . La formación de estos subproductos se puede evitar tratando los oligonucleótidos unidos al vehículo en fase sólida con soluciones de bases en un disolvente orgánico, como trietilamina al 50 % en acetonitrilo [83] o dietilamina al 10 % en acetonitrilo [84] .

Un oligonucleótido desprotegido se puede usar sin purificación adicional o se puede purificar aún más mediante uno de los siguientes métodos [85] .

  • El método más crudo para purificar un oligonucleótido es la desalinización, es decir, separar las impurezas de bajo peso molecular formadas durante la eliminación de los grupos protectores ( benzamida , isobutiramida , acetato de amonio, etc.). Para grandes cantidades de oligonucleótidos, la desalinización se realiza convenientemente por precipitación en etanol : en este caso, el producto precipita, mientras que las impurezas y, en algunos casos, los oligonucleótidos más cortos permanecen en solución. Para pequeñas cantidades, se utiliza la filtración en gel [86] .
  • La purificación de los oligonucleótidos truncados se puede realizar de manera eficiente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida , que se basa en la separación de los oligonucleótidos por tamaño debido a su diferente movilidad en el gel bajo la influencia de un campo eléctrico. Después de la electroforesis de absorción ultravioleta , se determina un fragmento de gel que contiene el oligonucleótido diana, esta parte se escinde y el oligonucleótido purificado se aísla por remojo o electroelución [87] .
  • La purificación más completa se logra mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En este método, la separación se basa en la interacción hidrófoba (HPLC de fase inversa) o de carga (HPLC de intercambio iónico) de los oligonucleótidos con un adsorbente. La fuerza de esta interacción afecta el orden y el tiempo de elución del producto de la columna cromatográfica, lo que hace posible separar efectivamente productos de varias longitudes. A menudo se utiliza un enfoque alternativo en el que el grupo 5'-DMT del oligonucleótido no se elimina antes de la purificación. En este caso, debido a la presencia de un grupo protector hidrofóbico, su hidrofobicidad y la fuerza de interacción con el sorbente hidrofóbico aumentan significativamente y la movilidad cromatográfica disminuye, lo que hace que el aislamiento del producto sea más eficiente. Luego, el grupo DMT se elimina en un medio ácido y la solución se evapora y se desaliniza [88] .

Caracterización

Al igual que con otras sustancias orgánicas, es útil caracterizar el oligonucleótido después de haberlo preparado. En casos más complejos (investigación o síntesis a gran escala), esto se hace dos veces: después de la desprotección y después de la purificación. Aunque el enfoque más correcto para caracterizar un oligonucleótido es la secuenciación , un procedimiento rutinario y relativamente económico, las consideraciones económicas impiden su introducción en la producción de oligonucleótidos. En la práctica diaria, basta con obtener el peso molecular de un oligonucleótido registrando su espectro de masas . Se utilizan dos métodos de espectrometría de masas: electropulverización y espectrometría de masas MALDI . Para obtener un espectro informativo, es importante reemplazar todos los iones metálicos que puedan estar presentes en la muestra con iones de amonio o trialquilamonio.

  • Cuando se ioniza con un electrospray, un oligonucleótido produce un conjunto de iones que corresponden a diversos grados de ionización del compuesto. Un oligonucleótido con un peso molecular M da iones con masas ( M  - n H ) / n , donde M  es el peso molecular del oligonucleótido en forma ácida (todas las cargas negativas de los enlaces fosfodiéster se compensan con la presencia de protones), n  es el grado de ionización, H es la masa atómica del átomo de hidrógeno (1 Sí). Los iones con n de 2 a 5 son los más útiles para la caracterización El software suministrado con los instrumentos modernos puede buscar automáticamente los picos de iones que pertenecen a un oligonucleótido particular y calcular el peso molecular de este último.
  • Para obtener información más detallada sobre las impurezas en un oligonucleótido, se utilizan métodos analíticos que combinan HPLC y espectrometría de masas [89] o electroforesis capilar y espectrometría de masas [90] .

Véase también

Notas

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Literatura

Principales obras originales

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Reseñas

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  • Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Síntesis de oligonucleótidos // Química integral de productos naturales . - Elsevier, 1999. - Págs. 105-152.
  • Reese CB Oligo y polinucleótidos: 50 años de síntesis química   // Org . Biomol. química - 2005. - vol. 3 , núm. 21 . - Pág. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .

Métodos

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