Oligonucleótidos de morfolina

Los oligonucleótidos de morfolino [1] [2] [3] u oligómeros de morfolino [4] ( ing.  morfolino, oligómero de morfolino, oligómero de morfolino de fosforodiamidato, PMO ) son oligonucleótidos sintéticos que se utilizan en biología molecular para cambiar la expresión génica . La base de la estructura molecular del oligonucleótido de morfolina son los anillos de metileno morfolina y los enlaces fosforodiamidato . Los oligonucleótidos de morfolina bloquean el acceso de otras moléculas a secuencias específicas pequeñas (alrededor de 25 nucleótidos de largo ) debido al emparejamiento complementario con el ARN correspondiente . Los oligonucleótidos de morfolina sirven como herramientas de investigación en genética inversa para la eliminación de genes .

La eliminación de genes es para evitar que la célula sintetice la proteína correspondiente [5] . Los oligonucleótidos de morfolina también pueden afectar el corte y empalme previo del ARNm [6] . La eliminación de genes es una herramienta poderosa para estudiar la función de un gen en particular . De manera similar, la escisión de un exón específico de una transcripción permite determinar las funciones realizadas por los residuos de aminoácidos correspondientes de la proteína y, a veces, conduce a la inactivación completa de la proteína. Los oligonucleótidos de morfolina se utilizan en el estudio de muchos organismos modelo , incluidos ratones , peces cebra , ranas y erizos de mar [7] .

Se están desarrollando formas de utilizar oligonucleótidos de morfolina en medicina contra organismos patógenos ( bacterias [8] y virus [9] ), así como para reducir la manifestación de enfermedades genéticas [10] .

Estructura

Los oligonucleótidos de morfolina son moléculas sintéticas que son ácidos nucleicos modificados [11] . Por lo general, tienen 25 nucleótidos de largo y se unen de manera complementaria a sus respectivas secuencias de ARN a través del apareamiento de bases . Los oligonucleótidos de morfolina tienen las bases nitrogenadas habituales, que en lugar de desoxirribosa están conectadas a anillos de morfolina , y no fosfato , pero los grupos fosforodiamidato están involucrados en el enlace de los nucleótidos individuales. Reemplazar los grupos fosfato con carga negativa por un grupo fosforodiamidato sin carga elimina la ionización a valores de pH fisiológicos , por lo que estas moléculas quedan sin carga en las células vivas. Toda la molécula de oligonucleótido de morfolina consta de dichos nucleótidos alterados [11] .

Funciones

Los oligonucleótidos de morfolina no degradan su ARN diana, a diferencia de muchas moléculas antisentido (p. ej., pequeños ARN de interferencia y fosforotioatos ). En cambio, actúan como "bloqueadores espaciales" uniéndose a la secuencia diana y evitando físicamente que otras moléculas se unan a ese ARN [5] . Los oligonucleótidos de morfolina se utilizan a menudo para estudiar el papel de ARNm específicos en el embrión en desarrollo. Los embriólogos las inyectan en huevos o embriones de pez cebra [12] , ranas con garras [13] , erizos de mar [14] y peces Fundulus heteroclitus , o entregan estas moléculas por electroporación a embriones de pollo en etapas posteriores de desarrollo [15] ; los embriones tratados de esta manera se denominan morfantes . En presencia de los sistemas de administración correctos en el citosol , los oligonucleótidos de morfolina también pueden ser efectivos en cultivos celulares [16] [17] .

Bloqueo de transmisiones

Al unirse a la región 5' no traducida del ARNm, los oligonucleótidos de morfolina pueden evitar que el ribosoma , en combinación con los factores de iniciación de la traducción eucariotas , se mueva desde la tapa hasta el codón de inicio . Esto evita la traducción de la región codificante del transcrito objetivo (caída del gen). Esta técnica es muy conveniente cuando el investigador quiere determinar la función de una proteína en particular; los efectos de la eliminación de genes en una célula u organismo se utilizan para juzgar la función de una proteína. Algunos oligonucleótidos de morfolina bloquean la expresión con tanta eficacia que después de la degradación de la proteína sintetizada antes de la introducción de los oligonucleótidos, esta proteína se vuelve indetectable mediante transferencia de Western [18] .

Cambio en el empalme de pre-ARNm

Los oligonucleótidos de morfolina pueden interferir con el procesamiento de pre-ARNm de las siguientes maneras:

• al evitar que las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas que dirigen el empalme ( snRNP ) se unan a sus objetivos en los límites de los intrones en el pre-ARNm;
• bloqueando el residuo de adenina , lleva a cabo un ataque nucleofílico durante el empalme y forma una estructura de lazo;
• interferir con la unión de proteínas de empalme reguladoras como silenciadores [19] y potenciadores de empalme [20] .

La prevención de la unión de las ribonucleoproteínas U1 (en el sitio donante) o U2 / U5 (en el tracto de polipirimidina o en el sitio aceptor) puede conducir a un empalme modificado en el que los exones se excluyen del ARNm maduro . El impacto en otros sitios de empalme lleva a la inclusión de intrones en el ARNm maduro, mientras que la activación de sitios de empalme ocultos puede conducir tanto a inclusiones como a exclusiones [21] . Los oligonucleótidos de morfolina también pueden bloquear objetivos snRNP U11 / U12 [22] . Los cambios en el empalme se controlan convenientemente mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y electroforesis (durante la electroforesis de los productos de RT-PCR, se observan cambios de banda en el gel) [6] .

Otros usos

Los oligonucleótidos de morfolina se han utilizado para bloquear la actividad de los microARN [23] [24] y su maduración [25] . Los oligonucleótidos de morfolina marcados con fluoresceína en combinación con anticuerpos específicos de fluoresceína se pueden utilizar como sondas de hibridación in situ con microARN [26] . Además, pueden bloquear la actividad de las ribozimas [27] así como el funcionamiento de las snRNP U2 y U12 [28] . Los oligonucleótidos de morfolina que se dirigen a secuencias de ARNm desnudo dentro de la región codificante pueden causar un cambio de marco durante la traducción [29] . También pueden bloquear la edición de ARN . La eficacia de los oligonucleótidos de morfolina con respecto a muchos objetivos los convierte en una herramienta universal para suprimir la interacción de proteínas o ácidos nucleicos con ARNm [30] .

Especificidad, estabilidad y efectos no antisentido

Los oligonucleótidos de morfolina se han convertido en una herramienta estándar para la eliminación de genes en los sistemas embrionarios de animales , que expresan más genes que las células adultas. Después de la inyección de un oligonucleótido de morfolina en embriones de rana o pez en la etapa de una o varias células, el mayor efecto aparece al quinto día [31] , cuando la mayor parte de la organogénesis y diferenciación de células y tejidos ya está atrás; los fenotipos observados corresponden a la desactivación de un gen en particular. Los nucleótidos de control que no se dirigen a ninguna secuencia generalmente no causan cambios en el fenotipo del embrión, lo que confirma que los oligonucleótidos de morfolina actúan de manera específica a la secuencia y generalmente no tienen efectos antisentido. La dosis requerida para la desactivación de genes puede reducirse introduciendo simultáneamente múltiples oligonucleótidos de morfolina dirigidos al mismo ARNm; este enfoque permite reducir o eliminar por completo las interacciones dependientes de la dosis de los oligonucleótidos con los ARN que no son dianas directas [32] .

En los experimentos para "rescatar" el ARNm en embriones, a menudo era posible devolver el fenotipo de tipo salvaje . Durante estos experimentos, se introduce un oligonucleótido de morfolina en la célula junto con el ARNm que codifica la proteína que este oligonucleótido debe destruir. Sin embargo, el ARNm introducido tiene una región 5' no traducida modificada y, por lo tanto, no tiene una secuencia diana para el oligonucleótido de morfolina, pero su región codificante se conserva y la proteína de interés se sintetiza a partir de ella. La traducción del ARNm "rescatador" restaura la formación de la proteína que fue detenida por el oligonucleótido de morfolina. El ARNm de rescate no causa anomalías fenotípicas, ya que no afecta la expresión de genes que no son el objetivo del oligonucleótido introducido, por lo que el regreso al fenotipo de tipo salvaje es otra evidencia de la especificidad de secuencia de los oligonucleótidos de morfolina [31]. .

Debido a la estructura química completamente antinatural, los oligonucleótidos de morfolina no son reconocidos por las proteínas celulares. Las nucleasas no las destruyen [33] , por lo que no se destruyen ni en las células ni en el plasma sanguíneo [34] . Los oligonucleótidos de morfolina no activan los receptores tipo Toll y , por lo tanto, no desencadenan una respuesta inmunitaria innata , expresada, en particular, en la formación de interferón o en la inflamación mediada por NF-κB [35] .

Hasta el 18% de los oligonucleótidos de morfolina causan fenotipos no asociados con los objetivos originales, en particular, la muerte de células del sistema nervioso central y somitas en embriones de pez cebra [36] . Se ha demostrado que la mayoría de estos efectos se deben a la activación de la apoptosis mediada por p53 ; pueden suprimirse introduciendo simultáneamente un oligonucleótido de morfolina experimental y su análogo anti-p53. Además, la activación de la apoptosis mediada por p53 inducida por el oligonucleótido de morfolina podría repetirse usando otras estructuras antisentido, lo que sugiere que la apoptosis mediada por p53 puede ser causada por la pérdida de la proteína diana y no depende del tipo de oligonucleótido utilizado para derribo [37] .

Los oligonucleótidos de morfolina deben usarse con precaución debido a sus posibles efectos fuera de la proteína diana. Se puede realizar un segundo experimento para probar si el fenotipo de morfante observado es el resultado de la eliminación del gen previsto o está causado por una interacción con un ARN que no es el objetivo directo del oligonucleótido introducido. Este experimento consiste en repetir el fenotipo ( fenocopia ) del morfante usando otro oligonucleótido de morfolina dirigido al mismo objetivo pero sin solaparse con el primer oligonucleótido [31] .

Entrega

Para que un oligonucleótido de morfolina actúe, debe ingresar al citosol de la célula y atravesar la membrana celular . Después de ingresar al citosol, comienza a difundirse libremente entre el citosol y el núcleo , como se demostró en experimentos en los que la introducción de un nucleótido de morfolina en el citosol de una célula cambió el empalme en el núcleo [6] . Se utilizan varios métodos para administrar un oligonucleótido de morfolina a embriones, células de cultivo o células animales adultas.

Por regla general, las microinyecciones se utilizan para la entrega a los embriones, y la introducción de oligonucleótidos se suele realizar en la etapa de una o varias células [38] . Un método alternativo para administrar oligonucleótidos de morfolina a los embriones es la electroporación, que permite administrarlos a los tejidos en etapas posteriores del desarrollo embrionario [39] .

Los métodos más comunes para administrar oligonucleótidos de morfolina en células de cultivo son el uso de un péptido endoportador ,  que provoca la liberación de oligonucleótidos de morfolina de los endosomas [17] ; un  sistema de entrega especial que utiliza un heterodúplex de ADN con un oligonucleótido de morfolina y polietilenimina etoxilada ] como reactivo de entrega (ya no está disponible comercialmente) [16] ; electroporación [40] ; raspado método de carga [ 41 ] . En 2015, se describió un sistema de administración anfipático de transactivación basado en ADN que está diseñado para administrar convenientemente ácidos nucleicos no cargados que tienen una cola poli(A), como ácidos peptidonucleicos y oligonucleótidos de morfolina [42] .  

La administración de oligonucleótidos de morfolina a los tejidos de animales adultos es difícil, aunque se han desarrollado varios sistemas para administrar oligonucleótidos de morfolina no modificados a los tejidos (en particular, a las células musculares naturalmente débiles en la distrofia muscular de Duchenne [43] o a las células endoteliales vasculares que están estresadas durante angioplastia [44] ). Aunque los oligonucleótidos de morfolina pasan efectivamente a través de los espacios intercelulares en los tejidos, su entrega a las células es difícil. El suministro sistémico a las células de muchos tipos se puede llevar a cabo con la ayuda de oligonucleótidos de morfolina unidos covalentemente a péptidos que penetran en las células y , mientras que las dosis medias de péptidos unidos tienen un efecto tóxico  [ 45 ] [46] , en condiciones in vivo , fue posible lograr un suministro eficaz de oligonucleótidos de morfolina a dosis de péptidos inferiores a las tóxicas [9] [47] . Un dendrímero de octaguanidina adherido al extremo de un oligonucleótido de morfolina (el llamado Vivo-Morpholino) asegura su envío desde la sangre al citosol cuando se inyecta sistemáticamente en un animal adulto [48] [49] .

Importancia médica

Los oligonucleótidos de morfolina capaces de una administración eficiente (como los oligonucleótidos de morfolina unidos a péptidos y Vivo-Morpholino) pueden ser agentes prometedores para el tratamiento de enfermedades virales y genéticas [50] . Por ejemplo, Sarepta Therapeutics Inc. ya está desarrollando oligonucleótidos de morfolina, un fármaco potencial llamado NeuGene. Actualmente, se están realizando ensayos clínicos con oligonucleótidos de morfolina , que pueden utilizarse para el tratamiento de la miodistrofia de Duchenne en humanos [51] .

Notas

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Enlaces

• Herramientas génicas: oligos antisentido de morfolino . (indefinido)