Riboswitch [1] ( eng. riboswitch ) es un elemento de la región 5' no traducida (5'-UTR) del ARNm . Lleva a cabo la regulación en cis del ARNm en el que se encuentra al unirse a ligandos : una variedad de moléculas pequeñas , por ejemplo, cobamamida , pirofosfato de tiamina , lisina , glicina , mononucleótido de flavina , guanina , adenina y otros. Un riboswitch típico tiene dos dominios principales : aptámeroun dominio que reconoce y se une a un ligando, y una plataforma de expresión que interactúa con proteínas de transcripción o traducción. El dominio del aptámero y la plataforma de expresión se superponen en la región de la llamada secuencia de conmutación, que es responsable de plegar el ARN en dos estructuras secundarias mutuamente excluyentes , por lo que se lleva a cabo la regulación.
Se han identificado ribointerruptores en representantes de los tres dominios vitales , así como en algunos virus [2] [3] .
Muchas bacterias pueden transportar las moléculas pequeñas necesarias del medio ambiente o sintetizarlas a partir de precursores simples. Cada uno de estos procesos requiere un conjunto diferente de proteínas , y las bacterias suelen utilizar un mecanismo de retroalimentación para controlar los productos de los pasos enzimáticos anteriores: un exceso del producto deseado inhibe su propia síntesis o activa los pasos enzimáticos posteriores. Por lo general, el nivel de metabolitos celulares es monitoreado por proteínas especiales que interactúan con el ADN o el ARN , regulando la síntesis de las enzimas correspondientes. Por esta razón, cuando se descubrió la supresión de genes para la biosíntesis de las vitaminas B 1 , B 2 y B 12 por compuestos como la tiamina , la riboflavina y la cobalamina , respectivamente, los principales esfuerzos se dirigieron a la búsqueda de proteínas represoras apropiadas que rastrear el nivel de estos compuestos. Sin embargo, no se han encontrado tales moduladores hipotéticos. Estos resultados llamaron la atención sobre el posible papel regulador de las secuencias de ARNm conservadas ("cajas") y sugirieron audazmente que es posible que el ARN controle directamente el nivel de estos derivados vitamínicos. Además, en 1998, Grundy y Henkin [4] demostraron que la región líder del ARNm de la mazorca de Salmonella typhimurium tiene conformaciones significativamente diferentes en presencia y ausencia de adenosilcobalamina (AdoCbl). Sin embargo, los intentos de probar directamente la unión de la cobalamina al ARNm no han tenido éxito. Se obtuvieron resultados similares con el ARNm de btuB de Escherichia coli : la adición de AdoCbl provocó que la transcriptasa inversa se detuviera cerca del extremo 3' de la región líder del ARNm durante la extensión del cebador in vitro , lo que, aparentemente, indica la estabilización de esta región al unirse al metabolito . [5] .
Finalmente, se ha demostrado que tres derivados de vitaminas, pirofosfato de tiamina (TPP), mononucleótido de flavina (FMN) y AdoCbl, interactúan directamente con sus respectivos ARNm para controlar los operones de las vitaminas B 1 , B 2 y B 12 . Estos informes han demostrado que la unión de metabolitos estabiliza la conformación de un sensor de ARN conservado evolutivamente (aptámero natural) e induce el plegamiento de regiones de ARN aguas abajo no conservadas en una estructura que afecta la terminación de la transcripción o el inicio de la traducción . Por lo tanto, la unión directa del metabolito al ARN hace que el ARNm "riboconmute" entre conformaciones alternativas, lo que afecta la expresión génica [5] . El término "riboswitch" fue propuesto en 2002 por Breaker y colegas [4] .
Desde el descubrimiento de los primeros riboconmutadores específicos de vitaminas, se han descubierto muchos otros tipos de riboconmutadores. Hasta el momento, se ha establecido que los ribointerruptores pueden responder a purinas y sus derivados, coenzimas proteicas y compuestos relacionados, aminoácidos y azúcares fosforilados . Algunos ribointerruptores reaccionan específicamente a ligandos inorgánicos , incluidos los metales ( iones Mg 2+ ) , que son atraídos por el esqueleto de azúcar-fosfato cargado negativamente del ARN y por los aniones flúor cargados negativamente [5] .
Funcional y estructuralmente, se pueden distinguir dos dominios en riboswitches. El primero de estos, el dominio aptámero, es responsable de la unión del ligando y forma un bolsillo de unión al ligando adecuado para un ligando en particular. El segundo dominio, conocido como plataforma de expresión, contiene un elemento interruptor de estructura secundaria que interactúa con proteínas reguladoras transcripcionales y traduccionales. El dominio del aptámero y la plataforma de expresión se superponen en el área de la secuencia de conmutación, que realiza la función reguladora. La secuencia de cambio dirige el cambio de dos estructuras mutuamente excluyentes de la plataforma de expresión, que corresponden a los estados "encendido" y "apagado" del ARNm [2] .
A pesar de la gran variedad de ligandos de riboconmutadores, la actividad reguladora de la gran mayoría de los riboconmutadores bacterianos está dirigida a cambiar la transcripción o traducción de genes responsables del transporte y síntesis de este metabolito. Esta actividad reguladora se basa en que, dependiendo de la presencia de un ligando, el ARN puede adoptar dos conformaciones mutuamente excluyentes. En el caso de la transcripción, dichas estructuras actúan como terminadores independientes de Rho o como horquillas anti-terminadores . En el caso de la traducción, los reordenamientos dependientes del ligando incluyen el empaquetamiento hacia afuera o hacia adentro de los sitios de unión al ribosoma ( sitio de unión al ribosoma , RBS ) o la secuencia Shine -Dalgarno ( SD ) . Estudios recientes han demostrado que los ribointerruptores pueden mediar en la terminación transcripcional dependiente de Rho. Este mecanismo regulador parece estar muy extendido, ya que varios ribointerruptores carecen de terminadores independientes de Rho o de horquillas que eliminan RBS o SD dentro de la molécula [5] .
Un modo inusual de regulación utiliza la ribozima ribozima glmS , que asegura que el ARNm se escinda después de unirse al metabolito. Este ARN no codificante generalmente se encuentra en bacterias Gram-positivas e interactúa con la glucosamina -6-fosfato (GlcN6P), que, después de unirse al ARNm de glmS , lo corta en el riboswitch. La RNasa J luego degrada la escisión comenzando en el extremo 5'-OH, evitando así la traducción del ARNm de glmS . El riboswitch-ribozyme glmS rompe la noción tradicional de que un riboswitch reconoce solo un compuesto: este riboswitch puede unirse a una variedad de compuestos relacionados y, por lo tanto, puede servir para evaluar el estado metabólico general de una célula [5] [4] .
Algunos riboswitches pueden estar involucrados en varios procesos regulatorios. El diguanosil-5'-monofosfato cíclico (c-di-GMP), un segundo mensajero , desencadena una serie de cambios fisiológicos y sus ribointerruptores correspondientes se encuentran junto a los genes implicados en la motilidad celular, la virulencia y otros procesos. Algunos riboswitches que funcionan con c-di-GMP están ubicados cerca de los intrones del grupo I de autoempalme . Estos reguladores de ARN funcionan a través de una compleja cascada de eventos que requieren la participación de ambas regiones reguladoras del ARN. c-di-GMP se une a su aptámero e induce un cambio de pliegue que permite que GTP ataque el extremo 5' del intrón . Como resultado, el intrón se escinde y las regiones RBS que están distantes entre sí se acercan entre sí, formando ARNm capaz de traducirse. Esta interacción alostérica combinada de las dos regiones de ARN da como resultado un sistema de control de dos puntos que reconoce las concentraciones de c-di-GMP y GTP y desencadena el empalme. Esta hipótesis requiere confirmación experimental [5] .
Después del descubrimiento de los ribointerruptores, se sugirió que estos elementos reguladores cis típicos también pueden actuar como elementos reguladores trans . Esto parece ser cierto al menos para los riboconmutadores de S-adenosilmetionina (SAM) SreA y SreB Listeria monocytogenes . Después de la terminación de la transcripción dependiente de SAM, estos ribointerruptores se unen de forma complementaria a la región 5' no traducida (5'-UTR) del ARNm que codifica el factor de virulencia PrfA y suprimen su expresión a nivel de traducción [5] .
En eucariotas, el desacoplamiento de la transcripción y traducción, así como la presencia de intrones, requiere la participación de varios mecanismos de regulación de la expresión génica. Los riboconmutadores de tiamina pirofosfato (TPP) eucarióticos no afectan la transcripción y/o la traducción, pero sí el empalme alternativo . El empalme "normal" ocurre cuando un sitio dentro de un riboswitch ubicado en un sitio intergénico o 3'-UTR se empareja de manera complementaria con un sitio que abarca uno de los sitios de empalme. Esto ocurre en ausencia de TRR. El producto obtenido tras el empalme se traduce en una proteína completa. Cuando el TPP está presente en una célula a una concentración umbral, se une al riboconmutador, lo que hace que un sitio de empalme oculto hasta ahora salga a la superficie y se vuelva accesible para el aparato de empalme. Dependiendo de la especie, el ARNm empalmado alternativamente contiene codones de parada internos que conducen a la traducción del péptido incorrecto ( hongos filamentosos ) o a la terminación prematura de la traducción ( algas verdes ). En plantas superiores, el empalme alternativo da como resultado transcripciones con 3'-UTR demasiado largas, lo que las desestabiliza [5] . A veces, los ribointerruptores pueden regular tanto la transcripción como la traducción. El riboswitch SAM-I responde a los cambios en la concentración de azufre con la formación de ARN antisentido , pero aún se desconocen los detalles del proceso de regulación [4] .
Aunque los ribointerruptores eucarióticos bien descritos se refieren solo a sistemas dependientes de TPP, un estudio reciente ha demostrado la presencia de aptámeros de ARN de unión a adenosina en genomas de vertebrados . El papel biológico de estos ARN aún se está estudiando. Algunos ARNm eucarióticos pueden responder a los cambios ambientales cambiando de una de las conformaciones alternativas a otra, de forma similar a los ribointerruptores. Por ejemplo, en respuesta a las señales del interferón-γ y la hipoxia , se produce un cambio de ARN en el ARNm 3'-UTR del factor de crecimiento endotelial vascular -A (VEGF), lo que afecta la traducción de VEGF en las células mieloides . Sin embargo, el cambio de conformación en este caso no está asociado con el metabolito, sino con la unión a proteínas en respuesta a un estímulo externo [5] .
Los ribointerruptores no siempre funcionan como unidades reguladoras únicas. A veces, dos dominios sensoriales o riboconmutadores completos (en el caso de los llamados riboconmutadores en tándem) son adyacentes. Por ejemplo, muchos ribointerruptores de glicina constan de dos sensores de glicina separados por un inserto de enlace corto y pueden adoptar una estructura terciaria muy compleja. Aunque los dos dominios sensoriales pueden ayudarse entre sí para plegarse y unirse a un ligando, el propósito biológico de tal duplicación aún no se ha establecido de forma inequívoca. El papel biológico de los ribointerruptores en tándem con diferentes especificidades es más claro. Modulan la expresión génica solo cuando todos los metabolitos necesarios están presentes en la célula. Las vías reguladoras mediadas por ribointerruptores pueden incluirse en otros sistemas de regulación de la expresión génica aún más complejos. Por ejemplo, los ribointerruptores SAM de L. monocytogenes funcionan solo a temperaturas que permiten la infección, cuando el termómetro de ARN adyacente cambia su conformación y se derrite. Otro ejemplo es el uso de la etanolamina de Enteroccus faecalis , en la que el ribointerruptor AdoCbl actúa junto con una proteína reguladora que afecta la estabilidad de los terminadores de la transcripción [5] .
La excepcional selectividad de los riboconmutadores se debe enteramente al conservadurismo de sus dominios sensores. Los sitios de reconocimiento de ligandos varían mucho en tamaño y complejidad de estructuras secundarias y terciarias . Para todas las clases principales de riboswitches, así como algunas subclases, se obtuvieron estructuras de dominios sensoriales en combinación con los correspondientes ligandos, se obtuvieron estructuras con alta resolución. Aunque los riboconmutadores tienen conformaciones muy diferentes (solo los riboconmutadores de purina estrechamente relacionados muestran cierta similitud), la estructura de la mayoría de los riboconmutadores contiene uniones multihélice y pseudonudos similares a ribozimas . Por esta razón, la mayoría de los riboswitches se pueden dividir en dos tipos según la estructura: el primer tipo incluye riboswitches, cuya estructura está representada por conexiones de varias hélices (riboswitches "conectantes"), y el segundo tipo incluye riboswitches con pseudonudos en la estructura [5] .
Los ribointerruptores de "conexión" se pueden dividir en dos subtipos, según la ubicación de la unión clave en la que está involucrada la hélice reguladora P1. Cubre el dominio del sensor y, por regla general, contiene una región que le permite conectarse a varios elementos estructurales. En los ribointerruptores de tipo Ia, la unión multihelicoidal ocupa una posición central y conecta las hélices restantes a la hélice P1, que, por regla general, participa en muchas interacciones que estabilizan la estructura terciaria de la molécula. Esto es lo que sucede en los riboconmutadores de purina y TPP. Una de las hélices puede ser mucho más larga que las otras y puede doblarse hacia la conexión multihélice, donde forma interacciones terciarias; así es como se organiza el riboconmutador de lisina, uno de los riboconmutadores más grandes descritos [2] . Los bolsillos de unión a metabolitos se forman dentro o cerca de la unión multiespiral, de modo que la unión del ARN al ligando afecta directamente la estabilidad de toda la unión multiespiral y la hélice P1 [5] .
Los ribointerruptores del segundo tipo (Ib) se caracterizan por la arquitectura "inversa" de las conexiones, en la que la conexión multihelicoidal clave está relegada a la periferia de la molécula y se encuentra lejos de la hélice P1. La hélice que emana de la unión se dobla hacia P1 y la estabiliza a través de interacciones terciarias de largo alcance. Los metabolitos se unen al ARN en la unión y/o cerca de P1, afectando su formación a través de la estabilización de la conformación general y las interacciones terciarias. Los representantes típicos de la clase Ib son el tetrahidrofolato (THF) y los ribointerruptores de magnesio [5] .
El subtipo II incluye riboconmutadores como SAM-II y riboconmutadores de fluoruro, cuyas estructuras están representadas en su totalidad por pequeños pseudonudos. Vale la pena enfatizar que los pseudonudos son partes importantes de algunos riboconmutadores "de conexión", pueden estar involucrados en la formación de bolsillos de unión a metabolitos, como en el caso del riboconmutador -ribozima glmS , así como en la formación de terciario de largo alcance. enlaces, como en el riboswitch SAM-I [5] .
Queda claro que la estructura del ribointerruptor y el ligando no están relacionados entre sí. Además, en las tres clases de ribointerruptores que reconocen SAM, hay varios elementos estructurales de conexión y pseudonudos. Además de las espirales y los pseudonudos , los elementos estructurales que se encuentran a menudo en los riboconmutadores incluyen giros en K ( giro retorcido, giro en K ), interacciones de bucle de beso, bucles de sarcina-ricina y bucles en T [2] . Esto muestra la asombrosa capacidad del ARN para asumir diferentes configuraciones para reconocer el mismo ligando. Vale la pena señalar que muchos riboswitches contienen motivos estructurales repetitivos que están presentes en otros ARN naturales y artificiales. Al igual que otros ARN funcionales, los riboconmutadores utilizan estos motivos como componentes básicos para construir estructuras espaciales complejas [5] .
Los ribointerruptores son capaces de reconocer ligandos de una amplia variedad de naturaleza química y no comparten ninguna característica común que les permita unirse a metabolitos. Sin embargo, hay una serie de características comunes en la unión de ligandos mediante riboconmutadores. La mayoría de los riboconmutadores forman bolsillos de unión rígidos que son ideales para unir porciones de estructuras de ligando reconocibles, y los ligandos pequeños caben completamente en dichos bolsillos. La unión del ligando provoca cambios estructurales en los riboconmutadores [2] . Los bolsillos suelen estar rodeados de nucleótidos conservados y pares de bases no canónicos dispuestos en una hélice irregular extendida o hélices convergentes. Con algunas excepciones, la mayoría de los ligandos utilizan heteroátomos para formar enlaces de hidrógeno específicos e interacciones electrostáticas con el ARN. A menudo, se forman enlaces de hidrógeno específicos entre los extremos de los ligandos y los nucleótidos de ARN no coincidentes conservados (p. ej., G40 en un sensor de aminopurina). Los grupos planos de ligandos, por regla general, participan en las interacciones de apilamiento y se intercalan entre las purinas de ARN. Los iones metálicos como Mg 2+ y K + pueden compensar la carga negativa del ligando o sus grupos funcionales como los residuos de fluoruro , carboxilo y fosfato . Los iones metálicos también están involucrados en las interacciones ligando-ARN a través de la coordinación directa o mediada por agua. Todas estas propiedades han sido demostradas en complejos de riboconmutadores y sus ligandos correctos usando análisis de difracción de rayos X de riboconmutadores no asociados a ligandos, así como riboconmutadores asociados con los ligandos correctos o ligandos muy similares a los correctos. Estos estudios concluyeron que los ribointerruptores se unen a sus ligandos correctos mediante una combinación de "selección conformacional" y mecanismos de forma inducida. Los ribointerruptores distinguen conexiones similares principalmente debido a inconsistencias espaciales, así como a la formación de interacciones específicas. La mayoría de los riboswitches son altamente específicos. Por ejemplo, la diferencia en la unión de un riboconmutador de purina a la adenina y la guanina alcanza las 10.000 veces, y el riboconmutador de lisina reconoce la lisina y la ornitina , que son muy similares en estructura, con una diferencia de 5.000 veces [2] . Curiosamente, los riboconmutadores de la misma clase pueden orientarse para reconocer diferentes concentraciones del mismo metabolito. También pueden diferir en los parámetros termodinámicos y cinéticos, en otras palabras, pueden diferir en la presencia de equilibrio entre el ARN y el ligando natural [5] .
El origen y evolución de los riboconmutadores es uno de los problemas más intrigantes en el estudio del ARN. Los experimentos in vitro han demostrado que el ARN puede adaptarse a la unión de ligandos con relativa facilidad, por lo que la selección natural tarda relativamente poco tiempo en convertir las secuencias de ARN en dominios de unión a metabolitos. Los ribointerruptores menos comunes pueden haber aparecido tarde en el curso de la evolución. Varios de estos eventos podrían dar lugar a clases independientes de riboswitches específicos para la misma conexión, como SAM. Al mismo tiempo, la presencia de riboconmutadores TPP en los tres dominios de la vida atestigua el antiguo origen de este tipo de riboconmutadores y su resistencia a la presión evolutiva. Según la hipótesis del mundo del ARN , en algún momento el ARN actuó como portador de información genética y como catalizador de reacciones químicas. La capacidad catalítica de glmS riboswitch-ribozyme , así como la capacidad de los riboswitches para interactuar con coenzimas "antiguas" como FMN, TPP y SAM, que probablemente estaban muy extendidas en las primeras reacciones bioquímicas , sugiere que moléculas como los riboswitches eran herramientas que aseguran la existencia y evolución del mundo primario del ARN. Es probable que los ribointerruptores fueran los elementos reguladores del mundo del ARN. Los ribointerruptores han sobrevivido hasta el día de hoy, quizás porque han creado un nicho de regulación metabólica que es más adecuado para el ARN que para las proteínas. Al mismo tiempo, la regulación con la ayuda de riboswitches consume más energía, ya que su implementación requiere la síntesis de ARNm del gen regulado. Al mismo tiempo, la regulación con la ayuda de riboswitches requiere menos pasos intermedios que la regulación con la ayuda de proteínas especiales [5] [2] .
Sobre la base de los principios de funcionamiento de los ribointerruptores, se están desarrollando nuevos interruptores genéticos artificiales. Por ejemplo, es posible modificar el aptámero y obtener un nuevo elemento de control que reconozca las sustancias que necesita el investigador. Se ha desarrollado un riboswitch artificial que no solo reconoce el elemento necesario, sino que también se autocorta, es decir, tiene actividad ribozima. Esta construcción se denominó "aptazim" y se puede usar en medicina para autocortar el ARNm viral en la célula y, en consecuencia, suprimir la expresión de los genes del virus [6] . Los ribointerruptores también pueden encontrar aplicación en la terapia génica [7] . Además, los riboswitches pueden ser muy útiles en el estudio de la biología bacteriana, por ejemplo, como herramienta para crear mecanismos artificiales para la expresión génica [8] [9] . Otra dirección en el desarrollo de ribozimas artificiales es la creación de biosensores que, en respuesta a la unión a ligandos, emiten algún resultado detectable, por ejemplo, una señal electroquímica o fluorescencia [4] [10] . Se han desarrollado ribointerruptores fluorescentes que permiten visualizar los cambios en las concentraciones de metabolitos en las células bacterianas [11] .
En 2016, se informó sobre la creación de "interruptores térmicos": la integración de termómetros de ARN sensibles a la temperatura y aptámeros de ribointerruptores en una sola estructura. Los interruptores térmicos funcionan como ribointerruptores a bajas temperaturas y reaccionan para unirse con su ligando cambiando la estructura, y a altas temperaturas entran en un estado permanentemente "encendido". Dichos reguladores de ARN artificial pueden utilizarse ampliamente para regular la expresión génica [4] .
Los ribointerruptores se consideran un objetivo prometedor para el desarrollo de nuevos antibióticos . Por ejemplo, la sustancia roseoflavina se une directamente al aptámero riboswitch FMN, reprimiendo la expresión del gen correspondiente en Bacillus subtilis . De manera similar, la aminoetilcisteína inhibe el crecimiento de algunas bacterias Gram-positivas al unirse al ribointerruptor de lisina. Sin embargo, la actividad antimicrobiana de los compuestos anteriores se reduce a nada por mutaciones en los ribointerruptores correspondientes [4] . Hay ribointerruptores que proporcionan resistencia a los antibióticos . Por lo tanto, el ribointerruptor de aminoglucósido se encuentra en el ARNm de las enzimas aminoglucósido acetiltransferasa y aminoglucósido nucleotidil transferasa, que proporcionan resistencia a los antibióticos aminoglucósidos. Cuando se une a un aminoglucósido, el riboswitch activa la transcripción de estas enzimas, proporcionando resistencia a los antibióticos aminoglucósidos [12] .
| Tipos de ARN | |
|---|---|
| Biosíntesis de proteínas | |
| procesamiento de ARN |
|
| Regulación de la expresión génica |
|
| elementos reguladores cis | |
| Elementos parásitos | |
| Otro |
|