El ARN circular ( ing. Circular RNA, circRNA ) es un tipo de moléculas de ARN , cuyos extremos están cerrados entre sí mediante un enlace covalente entre los nucleótidos terminales . Los CircRNA pueden formarse a partir de intrones o de bucles de varias regiones del transcrito en maduración . Aunque los ARN circulares suelen clasificarse como ARN no codificantes , ahora se acumulan pruebas de que pueden codificar péptidos [1] . Las funciones específicas de los ARN circulares no se comprenden completamente, pero es probable que participen en la regulación de la expresión génica . Los ARN circulares son especialmente abundantes en el cerebro y circulan libremente en el plasma sanguíneo . Quizás en el futuro, los ARN circulares se utilicen como biomarcadores para varios tipos de cáncer .
Teóricamente, el ARNc se puede obtener de tres formas diferentes. En primer lugar, durante el empalme , los intrones se eliminan del transcrito en maduración no como un fragmento lineal, sino como un lazo. Si cortas la "cola" de este lazo, obtienes ARN circular. Tales moléculas circulares intrónicas se acumulan principalmente en el núcleo y se denominan ciRNA (del inglés circular intronic long non-coding RNAs ). En segundo lugar, en el transcrito en maduración, los exones individuales pueden formar bucles, y el spliceosoma puede escindir dichos bucles y cerrarlos covalentemente en un anillo. Así es como se forman los ARN circulares, que consisten en un solo exón. Los ARN circulares, que consisten exclusivamente en exones, uno o más, se agrupan en el grupo ecircRNA (del inglés exonic circRNAs ) y generalmente se encuentran en el citoplasma . En tercer lugar, una región que contiene varios intrones y exones puede salirse. Cuando un asa de este tipo es extirpada y cerrada por un spliceosoma, se forman ARN circulares que contienen tanto exones como intrones. Se localizan principalmente en el núcleo y se denominan EIciRNA (del inglés exon-intron circRNAs ). Estas moléculas pueden continuar empalmándose y, después de la eliminación de los intrones, producirán ARN circulares que constan de varios exones [2] .
El proceso de escisión por parte del spliceosoma de secciones en bucle de la transcripción se denomina backsplicing . A menudo, los intrones que rodean un exón contienen repeticiones invertidas complementarias entre sí , que, formando enlaces de hidrógeno , forman el "tallo" del bucle. El bucle puede ocurrir con la participación de proteínas especiales : dos monómeros de dicha proteína se unen a los dos extremos del futuro bucle, se dimerizan y unen los extremos para que el empalmosoma pueda entrecruzarlos covalentemente. Hasta el momento, se conocen tres proteínas que regulan la formación de ciertos ARN circulares: Quaking (QKI), Muscleblind (Mbl/MBNL1-3) y Fusedinsarcoma ( FUS ). Por lo tanto, Muscleblind regula la formación de circRNA de su propio gen uniéndose a sitios específicos en los intrones de la transcripción inmadura. Además, la formación de circRNA depende de las proteínas que se unen al mRNA inmaduro en los sitios de escisión del cRNA, haciéndolos inaccesibles para el spliceosoma. Resumiendo, podemos decir que la biogénesis del ARNc es un proceso complejo regulado por una combinación de muchos factores, incluida la ubicación de las repeticiones invertidas y la interacción con las proteínas que median el bucle o, por el contrario, hacen imposible el backsplicing [2] .
Curiosamente, en algunas arqueas , la formación de ARNr pasa por la etapa de una molécula precursora circular, que luego se corta en ARNr individuales [3] .
El nivel de síntesis de cRNA varía según el tipo de célula . En promedio, los RNA circulares correspondientes se detectan para 5 a 20 % de los genes activos, y una célula individual contiene simultáneamente 5 000 a 25 000 circRNA. Sin embargo, representan una parte muy pequeña del transcriptoma : con raras excepciones, los circRNA constituyen del 5 al 10% de la cantidad de ARN mensajeros lineales sintetizados a partir del mismo gen. Como regla general, varias isoformas circulares de ARN se transcriben a partir de un gen y, con mayor frecuencia, el segundo exón del gen se incluye en el circARN, mientras que el primer y el último exón casi nunca permanecen en forma circular. Se puede regular la formación de una u otra isoforma. El nivel de síntesis de circRNA en general varía mucho durante la diferenciación celular , pero generalmente toma varios días o incluso semanas para que cambie significativamente [2] .
Al carecer de extremos libres, los ARN circulares no pueden ser degradados por las enzimas exonucleasas , que degradan muchos transcritos mediante la escisión persistente de los nucleótidos terminales. En este sentido, el ARN circular promedio es más estable que el ARNm lineal: el circARN vive de 19 a 24 horas (a veces hasta 48 horas), que es de 2 a 5 (hasta 10) veces más que la vida de las moléculas lineales. Hay varias hipótesis sobre cómo se degradan los ARN circulares. Los ARN circulares pueden escindir las endonucleasas , que no destruyen los ácidos nucleicos de los extremos, sino que introducen rupturas en las partes internas de la molécula. Probablemente, en este caso, un complejo que contiene miRNAs , que "inducen" a las endonucleasas del grupo Argonaute a las moléculas diana, es el responsable de la destrucción. En los circRNA a degradar, algunos residuos de adenosina pueden metilarse específicamente . Dichos ARN metilados son reconocidos por proteínas especiales que los transfieren a los sitios de degradación de los ácidos ribonucleicos, los llamados cuerpos P . En la destrucción de circRNA, pueden estar involucrados orgánulos especiales : autofagosomas , entre otras cosas que contienen endonucleasas. Las células pueden liberar el exceso de circRNA en la sangre como parte de las vesículas extracelulares . Si existen algunas confirmaciones experimentales para la primera vía hipotética de destrucción de los ARN circulares, los modelos restantes aún están a la espera de su verificación experimental [2] .
Se describen los efectos biológicos tanto de los propios ARN circulares como del proceso de su formación. Además, los ARN circulares pueden codificar péptidos que también realizan ciertas funciones celulares. Aunque el backsplicing que conduce a la formación de circRNA es 100 veces más raro que el empalme lineal ordinario, es probable que estos dos procesos compitan entre sí y se supriman mutuamente. Es posible que la supresión del empalme lineal durante la formación de ARN circulares sea la principal función celular de estas moléculas. Salir de la región del transcrito inmaduro debido a la unión complementaria de las repeticiones invertidas en los intrones puede suprimir efectivamente el corte y empalme lineal. Además, tanto el empalme inverso como el empalme lineal requieren las mismas regiones de la transcripción; por lo general, están involucrados en un proceso lineal, que en la mayoría de los casos suprime el empalme inverso. De hecho, se ha demostrado que los ARN circulares y los ARNm lineales ordinarios del mismo gen no se sintetizan simultáneamente. Sin embargo, la evidencia experimental sugiere una relación más compleja entre lineal y backsplicing que la supresión competitiva convencional. Es posible que la tasa de transcripción desempeñe un papel importante en el que se leerá el ARN del gen : ARNm o circular. Por lo tanto, el empalme alternativo a menudo conduce a la formación de intrones que contienen lazo (es decir, posibles precursores de ARN circular), y esto ocurre a menudo cuando se acelera la transcripción. La elección entre backsplicing y linear splicing también puede basarse en mecanismos más complejos. Se supone, por ejemplo, que el ARN circular, que se lee del gen mbl, se hace cargo de todo el producto proteico de este gen, Muscleblind. Se sabe que esta proteína es necesaria para la formación de mbl-mRNA lineales, por lo tanto, al unirse a ella e impedir su funcionamiento, los mbl-RNA circulares (circMbl) inhiben la síntesis de sus “hermanos” lineales. Tampoco se excluye la posibilidad de unión complementaria de los ARN circulares a las regiones de los genes que los originaron, es decir, al ADN . [2] .
Varios experimentos sugieren que EIciRNA (exón-intrón) y ciRNA (intrón) afectan la transcripción de sus propios genes al estimular la ARN polimerasa II . Los investigadores pudieron precipitar el complejo EIciRNA con la ARN polimerasa II usando anticuerpos , y resultó que se necesita otro componente para estimular la polimerasa : el ARN nuclear pequeño U1 . Quizás, al interactuar con EIciRNA, U1 se ubica de tal manera que estimula la polimerasa. Al mismo tiempo, los ciRNA parecen poder unirse directamente a la cromatina en la región de los genes "padres" y aumentar la tasa de transcripción. Fue posible precipitar, por ejemplo, ciRNA llamado ci-ankrd52 en complejo con una ARN polimerasa II que trabaja activamente (la forma activa de la enzima se distingue por una fosforilación especial del dominio C-terminal ). Dado que los ciRNA también pueden unirse a secuencias de ADN "extrañas", su papel en el control de la expresión génica puede ser significativo [2] .
Para dos ecircRNAs (exónicos, localizados en el citoplasma), se ha demostrado experimentalmente la capacidad de influir en la síntesis de proteínas . circANRIL interrumpe el complejo de proteínas que procesan el ARNr, lo que reduce el número de ribosomas funcionales y la producción de proteínas. Al mismo tiempo, circPABPN1 suprime el trabajo de la proteína HuR , que es necesaria para la traducción de varios ARNm [2] .
Los ARN circulares pueden servir como base estructural para el ensamblaje de complejos de proteínas y, por lo tanto, proporcionar interacciones de proteína a proteína . Por ejemplo, a través de circ-Foxo3, la cinasa 2 dependiente de ciclina (Cdk2) interactúa con su inhibidor , p21 , lo que provoca la detención del ciclo celular . Además, los ARN circulares pueden secuestrar proteínas, lo que limita su movimiento a los trabajos. Por lo tanto, el circ-Foxo3 antes mencionado puede "bloquear" el factor de transcripción E2F1 y algunas otras proteínas en el citoplasma [3] .
Algunos ARN circulares exónicos contienen sitios de unión para reguladores negativos de la expresión génica, microARN. En la literatura inglesa, estos circRNA se denominan a menudo esponjas de microARN o esponjas que absorben microARN. Al unirse a ellos, los microARN ya no pueden interactuar con los ARNm diana complementarios e interferir con su traducción. Por ejemplo, el ARNc de CDR1as contiene 74 sitios de unión de microARN miR-7, y la lectura de ARNc de ratón del gen Sry (importante para la determinación del sexo ) contiene 16 sitios de unión de miR-138. Cabe señalar, sin embargo, que solo se ha demostrado que unos pocos ARN circulares se unen a los microARN, es decir, esta es la excepción y no la regla. Curiosamente, se han encontrado circRNA en algunos eucariotas unicelulares que no tienen microRNA en absoluto, a saber, la levadura Saccharomyces cerevisiae y el plasmodio palúdico Plasmodium falciparum . Por lo tanto, la unión a los microARN no puede ser la función principal de los ARN circulares [2] .
Varios ARN circulares juegan un papel importante en la inmunidad antiviral . Por ejemplo, los pollos resistentes al virus de la leucemia aviar producen 12 circRNA en mayor cantidad que los pollos normales. Muchas de estas moléculas se unen a microARN que regulan la expresión de genes que están asociados con procesos inmunitarios como la activación de linfocitos B y la presentación de antígenos . Curiosamente, el sistema inmunitario también influye en la síntesis de ARN circulares. Por ejemplo, los factores inmunitarios NF90 y NF110 (variantes de empalme del gen ILF3 ) estimulan la formación de circRNA a partir de un transcrito en maduración en el núcleo. En las condiciones de una infección viral, estas proteínas van al citoplasma, donde se unen al ARNm viral e inhiben el ciclo de vida del virus ; la cantidad de circRNA nuclear disminuye, lo que puede modular la expresión génica. Los CircRNA también pueden participar en la supresión de la infección al unirse a miRNA virales o celulares que interfieren con la respuesta inmune [3] .
Se sabe que la mayoría de los eventos de backsplicing involucran exones y ocurren en el ARN de los genes que codifican proteínas. La traducción de la mayoría de los ARNm comienza con el reconocimiento por parte del ribosoma de un nucleótido modificado en el extremo 5' del ARNm, el llamado cap . Los CircRNA no tienen un extremo 5 'libre, por lo que no pueden tener una tapa. Sin embargo, algunos ARN celulares y virales pueden traducirse en ausencia de una tapa con la participación de una secuencia especial: IRES . Lo mismo podría ocurrir con los ARN circulares [2] [3] .
De hecho, los circRNA artificiales que contienen IRES y codifican algún péptido podrían traducirse. Sin embargo, se ha demostrado que la mayoría de los ARN circulares en las células vivas no están asociados con los ribosomas, por lo que es poco probable que su traducción sea generalizada. Hasta el momento, se conocen dos ARN circulares que es probable que sinteticen proteínas in vivo , estos son circMbl y circZNF609. Vale la pena señalar que estas moléculas se forman de manera algo no estándar: en el primer caso, el empalme inverso afecta al primer exón, que, como recordamos, generalmente no se incluye en los ARN circulares, y en el segundo, un fragmento del 5 ' -La región no traducida de la transcripción original ingresa al circRNA, que tiene las propiedades IRES. Es posible que la síntesis de proteínas por circRNA solo sea posible en condiciones especiales, por ejemplo, bajo estrés: choque térmico o inanición [2] .
Si asumimos que algún ARN circular contiene un marco de lectura abierto con un número de nucleótidos que es un múltiplo de tres, entonces, en teoría, la traducción de dicho ARN puede proceder de acuerdo con el mecanismo del anillo rodante . El resultado de tal traducción sería teóricamente una cadena interminable de bloques repetidos de aminoácidos , y su crecimiento estaría limitado por la procesividad de los ribosomas. Todavía no se conocen casos similares para los ARNc celulares, pero algo similar ocurre con el ARNc de viroide asociado con el virus de la mancha amarilla del arroz [2] .
Los avances recientes en la detección de cRNA se deben a las mejoras en la tecnología de secuenciación de RNA , como el aumento de la longitud de las lecturas individuales la mejora de los algoritmos para hacer coincidir el RNA con genes conocidos y la expansión de las bibliotecas de RNA Los ARN circulares se pueden distinguir de los ARN lineales utilizando un enfoque bioinformático (basado en los resultados de la secuenciación) o un método "húmedo" que utiliza exonucleasas. Como se mencionó anteriormente, estas enzimas escinden rápidamente los ARN lineales pero no afectan a los ARN circulares. Se han identificado miles de ARN circulares utilizando exonucleasas, pero la mayoría de los circARN se han descrito gracias a la secuenciación de alto rendimiento utilizando algoritmos especiales [4] .
Actualmente existen varias bases de datos dedicadas a los RNA circulares y herramientas online para trabajar con ellos. Entre ellos [5] :
Los ARN circulares se encuentran en diferentes cantidades en el plasma sanguíneo, y en la sangre periférica son incluso más numerosos que en las células de los órganos . Las razones de esto no están claras, especialmente considerando el hecho de que en suero al 25%, los circRNA se degradan después de solo 30 segundos (el ARN circular promedio existe en la célula durante 1-2 días). Sea como fuere, la presencia y cantidad de ciertos ARN circulares en el plasma sanguíneo puede servir como un indicador importante de la salud del cuerpo. En otras palabras, los cRNA se pueden usar como biomarcadores para diagnosticar y estadificar patologías como la enfermedad coronaria , varios tipos de cáncer (incluida la leucemia ), la diabetes y la esclerosis múltiple [2] .
Algunos ARN circulares están asociados con la senescencia celular . Por lo tanto, circPVT1 actúa como un inhibidor del envejecimiento de los fibroblastos en proliferación [4] . Varios ARN circulares están asociados con cambios en el cuerpo relacionados con la edad: por ejemplo, se han identificado moléculas asociadas con el envejecimiento muscular en monos [6] .
Hasta la fecha, se conocen 10 ARN circulares que están implicados en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares y metabólicas (por ejemplo, diabetes mellitus). El circANRIL ya mencionado puede proteger contra la aterosclerosis al inhibir la maduración del ARNr y, por lo tanto, inhibir la división celular , cuya proliferación excesiva conduce a la formación de placas ateroscleróticas . Un ARN circular llamado MICRA puede señalar la disfunción ventricular izquierda debido a un infarto de miocardio . Con la hipertrofia del corazón y la insuficiencia cardíaca , se observa una disminución en la síntesis de varios ARN circulares [2] .
Se ha demostrado que algunos ARN celulares están asociados con la diabetes mellitus. Se sabe que la sobreproducción de microARN miR-7 en las células β pancreáticas contribuye al desarrollo de diabetes, mientras que la sobreproducción de ciRS-7, un ARN circular que se une a miR-7, en estas células, por el contrario, mejora la secreción de insulina . 4] .
En los tejidos nerviosos de varios organismos (desde moscas de la fruta hasta humanos), se encuentran especialmente muchos ARN circulares. Quizás esto se deba a la mayor prevalencia del splicing alternativo en las neuronas . Además, los ARN circulares en ellos pueden realizar funciones especiales relacionadas con la conducción de los impulsos nerviosos . La proteína Qki , implicada en la formación de circRNA, participa en el desarrollo de oligodendrocitos y regula la mielinización , además de inhibir la formación de dendritas en el sistema nervioso central . Las mutaciones en el gen de esta proteína están asociadas con la ataxia y la esquizofrenia [2] . También hay evidencia de una asociación de los ARN circulares con la enfermedad de Alzheimer [4] [6] .
Más de 20 cRNA se han relacionado con el desarrollo de diversos tipos de cáncer, como el cáncer colorrectal , de ovario , de vejiga , de mama , de hígado , de estómago , de riñón y de próstata . Los procesos oncológicos a menudo van acompañados de translocaciones , que conducen a la aparición de especies de circRNA específicas del tumor . Muy a menudo, los ARNc asociados con el cáncer funcionan como esponjas para los miARN [2] .